硼中子俘獲治療人腦膠質(zhì)瘤的研究進(jìn)展

馬 彭，董啟珊，陳業(yè)高，王麗瓊

(云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明 650500)

1 人腦膠質(zhì)瘤的治療現(xiàn)狀和BNCT的概念

人腦惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤是人體顱內(nèi)常見的腫瘤之一，目前的治療方式主要有化療、放療、手術(shù)和基因治療等，但效果均不理想。特別是，惡性程度較高的多形性型腦膠質(zhì)瘤(Giloblastoma Mutiforme，GBM)，由于其浸潤性較高，沒有可以憑借肉眼觀察到的清晰的邊緣，很難通過傳統(tǒng)的方法切除治療，容易復(fù)發(fā)，中位生存期只有13～17月。因此，從20個世紀(jì)50年代開始，BNCT作為一種新的化療方法開始成為人們探索治療癌癥的新方向。

2020年5月，在經(jīng)過最新21例BNCT臨床試驗后，一年無進(jìn)展生存率為71%，效果很好，副作用較低，日本南東北醫(yī)院(Southern Tohuku Hospital Group)宣布使用BNCT接收治療頭頸部惡性腫瘤患者進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗，對治療的有效性和治療范圍進(jìn)行深度研究。這一治療成果使BNCT作為一種新的化療方式又引起了廣泛關(guān)注[1]。

BNCT是基于在癌細(xì)胞的10B原子核反應(yīng)，利用裂變中產(chǎn)生的高能線密度α粒子(4He)，使之能夠摧毀癌細(xì)胞的治療方法。第一步是給病人注射足量的含有10B藥物，使有選擇性的10B大量進(jìn)入癌細(xì)胞中。當(dāng)癌細(xì)胞攝取了含有10B的藥物之后，從外部用能量為0.0253eV的熱中子(1n)照射病變部位，在癌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生裂變反應(yīng)，產(chǎn)生了11B和α粒子以及鋰原子。α粒子具有較高的輻射能量，可以殺死癌細(xì)胞，同時由于α粒子射程僅10 μm，小于一個細(xì)胞的直徑，所以只能殺死癌細(xì)胞而不會影響周圍健康的細(xì)胞。因著這一原理，BNCT成為一種溫和高效的化療方式(圖1)。

圖1 硼中子俘獲原理

2 BNCT治療的人腦惡性膠質(zhì)瘤病例研究進(jìn)展

自20世紀(jì)50年代，美國就開始了BNCT的臨床治療實驗，第一例惡性腦瘤患者用Brookhaven Graphite Research Reactor 進(jìn)行了治療，這是最初采用的中子發(fā)射器,后續(xù)有數(shù)名腦瘤患者參與了治療試驗。當(dāng)時用于治療的中子源對腦部腫瘤細(xì)胞的穿透能力非常弱，而且選用了一些無機(jī)硼酸作為注射藥物，非靶向硼化合物不僅在腫瘤細(xì)胞中聚集，也在正常細(xì)胞中聚集[2-3]。治療后的患者因此產(chǎn)生了強(qiáng)烈的副作用，包括輻射引發(fā)的皮膚病、腦水腫、腦梗以及腦細(xì)胞壞死等，實驗以失敗告終。1961年，美國停止了BNCT的臨床試驗。

在美國開展這項研究的Hiroshi Hatanaka教授在試驗失敗后回到了日本，并在日本接著開展此項試驗。改進(jìn)后的試驗直接用中子對顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行照射，此次試驗讓10%的患者能夠達(dá)到5年生存率[4]，10年生存率達(dá)到了5.7%。這項研究再次引起了廣泛關(guān)注[5-6]。

美國布魯克哈文實驗室在1994—1999年間共治療53例多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，平均年齡56.5歲，腫瘤大小平均為20.5 cm3，KPS評定為80，總生存期為12.8月。在2005年以后，該實驗室陸續(xù)收治了46名腦瘤患者，雖然所有的患者在經(jīng)過BNCT治療以后都發(fā)現(xiàn)腫瘤萎縮變小了，但很多患者最后還是發(fā)生了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至未經(jīng)輻射的部位。治療效果最好的一個患者預(yù)后良好， BNCT治療之后，每兩周用貝伐珠單抗治療，在84月后發(fā)現(xiàn)腫瘤完全消失。貝斯以色列醫(yī)學(xué)中心共收治26例患者，總生存期為11月。

2005年，德國杜伊斯堡-埃森大學(xué)[7]試驗了26例患者，總生存期為10.4～13.2月。2011年，芬蘭赫爾辛基中心醫(yī)院報導(dǎo)[8]該院共收治復(fù)發(fā)性腦瘤患者50例，總生存期達(dá)到了21.9月。瑞典尼雪平醫(yī)院試驗了31例患者，總生存期最高為17.7月。

在1999年至2007年間，日本筑波大學(xué)(Yamamoto, Nakai et al.2009, Kageji, Mizobuchi et al.)、德島大學(xué)和大版醫(yī)科大學(xué)[9]共進(jìn)行了90例惡性腦膠質(zhì)腫瘤的臨床試驗，其中有多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme),漸變性星型細(xì)胞瘤(anaplastic astrocytoma), 間變性少突-星形細(xì)胞瘤(anaplastic oligoastrocytoma)，中位生存期從10.8月到27.1月，兩年生存率平均達(dá)到了24.1%。

Minoru Suzuki 組[10]用BNCT在2001年到2007年間治療了62例復(fù)發(fā)頭頸部腫瘤的病例，療效穩(wěn)定，一年生存率達(dá)到41%。Heikki Joensuu 組在赫爾辛基大學(xué)醫(yī)院對79例之前接受分次放療又復(fù)發(fā)的患者進(jìn)行了治療，其中38%的患者可以達(dá)到兩年無進(jìn)展生存期，總生存率為21%。

在中國，Wang Lingwei 組在臺北榮民總醫(yī)院對17例患者進(jìn)行了同樣的治療后發(fā)現(xiàn)一年生存率達(dá)到56%，兩年局部控制率為28%，兩年生存率為47%[11]。

Iara S.Santa Cruz用RA-6作為中子源對5只患頭頸部腫瘤的寵物狗進(jìn)行治療，生存壽命延長了8.5月至13.5月，超出了預(yù)計的生存時間，取得較好的效果。治療后的結(jié)果顯示，所有的病例都有明顯的部分緩解，其中1例腫瘤減小50%。這一結(jié)果對人頭頸部腫瘤的治療有重要的借鑒意義。當(dāng)然，值得注意的是，中子進(jìn)入腦部的深度只達(dá)到了1 cm左右，這是一個讓治療不能充分進(jìn)行的關(guān)鍵因素，其中兩例發(fā)現(xiàn)了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肺[12]。

日本南東北醫(yī)院的近期試驗結(jié)果(2019年公布)顯示，全部21例患者中，完全緩解(CR)為5例(23.8%)，部分緩解(PR)為10例(47.8%)，穩(wěn)定未發(fā)展(SD)5例(23.8%)，出現(xiàn)新病灶的為0例，有1例(4.8%)無法評估[13]。

從這些治療的結(jié)果來看，日本在頭頸部腫瘤的治療方面取得了重要的進(jìn)展，而頭頸部腫瘤用BNCT治療的效果總體比腦膠質(zhì)瘤好。目前腦膠質(zhì)瘤的臨床Ⅰ、Ⅱ期試驗仍然困難重重，主要的原因還是與藥物無法有效聚集在腦腫瘤細(xì)胞和中子未能夠精準(zhǔn)到達(dá)腫瘤位置有關(guān)系。

3 BNCT誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)理

腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)理對于腫瘤治療有著非常重要的意義，對腫瘤細(xì)胞的抗凋亡蛋白研究能夠很好地詮釋腫瘤細(xì)胞的耐藥性和腫瘤復(fù)發(fā)。然而，也有觀點認(rèn)為，沒有證據(jù)表明抗腫瘤治療與腫瘤細(xì)胞凋亡之間有必然聯(lián)系。目前，細(xì)胞凋亡機(jī)理仍然是研究者關(guān)注的熱點之一。本文綜述了部分關(guān)于BNCT治療中腫瘤細(xì)胞凋亡的研究觀點。

大部分射線進(jìn)入生物體內(nèi)都有化學(xué)輻射反應(yīng)，中子也不例外，直接的離子射線靶點是DNA。除此以外，研究表明在照射中產(chǎn)生的自由基和離子碎片可以破壞一些生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)、脂類和多糖等[14]。這些大分子的改變對于BNCT作用于腫瘤細(xì)胞的機(jī)理也產(chǎn)生了不同的影響。在治療過程中發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中的染色體異常比傳統(tǒng)的化療方式更多，致死率更高。同時發(fā)現(xiàn)BNCT能通過Bcl-2/Bax途徑和線粒體調(diào)控細(xì)胞色素C的釋放和Caspase-9的激活來加速腦腫瘤細(xì)胞凋亡[15]。超熱中子能夠讓50%的DNA發(fā)生鏈斷裂，同時隨著10B在細(xì)胞內(nèi)濃度的增加，DNA單鏈或者雙鏈斷裂的傾向更大。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，在BNCT的治療中，自噬內(nèi)吞作用是由變異基因Beclin1，PARK2和PINK1引發(fā)的[16]。從目前的研究來看，用BNCT治療以后的細(xì)胞凋亡機(jī)理仍然處于探索階段。

4 硼中子俘獲治療的藥物研究進(jìn)展

在開展BNCT 的研究過程中，含硼藥物的選擇非常重要，基于半個世紀(jì)的研究結(jié)果與數(shù)據(jù)，很多的含硼藥物被研究者合成出來。從治療的過程來看，BNCT對含硼藥物需要達(dá)到一下基本要求：

1)含硼藥物一般通過滴注的方式進(jìn)入患者體內(nèi)，要求10B在腫瘤上的聚集達(dá)到10～30 μg/g，并且有一定的停留時間，能夠使中子充分到達(dá)腫瘤內(nèi)部發(fā)揮作用。

2)含硼藥物必須對腫瘤細(xì)胞有較高的選擇性，也就是10B在腫瘤細(xì)胞和正常組織、血液中的分配比例(T/N值，T/B值)至少要達(dá)到3以上。

3)高水溶性和低毒性。

從1990年開始，用于臨床試驗的有效的含硼藥物主要是BSH(polyhedral boron anion, sodium mercaptoundecahydro-closododecaborate,Na2B12H11SH)和BPA((l)-4-dihydroxyborylphenylalanine)兩種(圖2)。BSH不能透過血腦屏障，當(dāng)血腦屏障被破壞的時候，BSH可以進(jìn)入并有效地聚集在腦腫瘤部位。而BPA則可以順利通過血腦屏障進(jìn)入顱內(nèi)，但是有小部分BPA停留在正常細(xì)胞中，多余的BPA在患者尿液中代謝出來并結(jié)晶引起發(fā)燒，后來用增加給水的方式來預(yù)防[17]。雖然后續(xù)有很多含硼藥物被設(shè)計合成出來，然而現(xiàn)在進(jìn)入臨床試驗的還是這兩種較早開發(fā)的藥物。

圖2 BSH 與 BPA 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

日本南東北醫(yī)院使用的含硼試劑為Steboronine(9 000 mg/300 mL靜脈注射)，分子結(jié)構(gòu)為(S)-2-amino-3-[4-(10B)dihydroxyboranyl phenyl]propanoic acid(S-BPA)。主要的副作用為脫發(fā)癥90.5%(19/21例)、淀粉酶增加85.7%(18/21例)、惡心81.0%(17/21例)、味覺異常71.4%(15/21例)、腮腺炎以及食欲減退66.7%(14/21例)、口腔炎61.9%(13/21例)。

現(xiàn)在有很多研究者都致力于開發(fā)新型的含硼試劑，并將其應(yīng)用于BNCT中。如硼代卟啉[18-20]，H2OCP對人喉癌HEp2細(xì)胞不敏感，但是能夠聚集在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G中，在3 h內(nèi)細(xì)胞攝取率達(dá)到了0.03 μmol/1 000細(xì)胞[19](圖3，H2OCP，Octa-anionic 5,10,15,20-tetra[3,5-(nidocarboranylmethyl) phenyl]porphyrin)。銨鹽基團(tuán)的引入是化合物能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并快速聚集的關(guān)鍵(圖3，卟啉銨鹽)，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)卟啉主要通過內(nèi)吞作用集中在溶酶體中。

很多新的硼代葡萄糖[21]，硼代多糖[22]，硼代核酸[23]，硼代抗體[24]，硼代磷脂和硼代氨基酸[25]等都被合成并探索了它們的藥物活性(圖3)。

圖3 BNCT含硼化合物

如以表皮生長因子(EGFR)介導(dǎo)的單克隆抗體(mAbs)，cetuximab(IMC-C225),和EGFRvIII的L8A4抗體，實際操作中使用PAMAM聚酰胺胺型樹枝狀高分子聚合物作為載體，將網(wǎng)狀硼烷Na(CH3)3NB10H8NCO和單抗偶聯(lián)在一起，能夠通過識別腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)的EGFR或者變異的EGFRvIII蛋白來達(dá)到輸送硼試劑的目的，檢測發(fā)現(xiàn)T/N比例為9.9，硼的聚集濃度達(dá)到了24.4μg /g(藥物/腫瘤)，達(dá)到含硼試劑的基本要求[26]。

2020年Takao Tsurubuchi組上報導(dǎo)了一個新的BNCT候選藥物，結(jié)構(gòu)如圖3中的MMT1242。該化合物在CT26小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞、B6-F10小鼠皮膚黑色素瘤和C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞中都有較高的攝取率，是BPA的兩倍以上。同時，小鼠試驗顯示，此藥物在腫瘤上的停留時間在60 min以上，具備了BNCT治療的理想條件。同時發(fā)現(xiàn)，在化合物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞24 h之后，此化合物已經(jīng)表現(xiàn)出中等抗癌活性，對BNCT的治療更添助力[27]。

5 目前治療中存在的問題

1)從使用量來看，一次治療的劑量為靜脈注射 9 000 mg，這是一個很大的量，因此引發(fā)的副作用也不可小覷。從日本南東北醫(yī)院的治療方案來看，21例患者全部都有不同類型，不同程度的副作用出現(xiàn)。因此改進(jìn)含硼藥物的結(jié)構(gòu)，提高治療效率，減少治療用量，減少副作用仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的課題。

2)雖然基于不同靶點和機(jī)理的含硼化合物都被設(shè)計出來，但是在初期生物活性試驗或后期的動物試驗中的結(jié)果都不理想，因此，這些藥物前體結(jié)構(gòu)都有待進(jìn)一步改進(jìn)和提高。

3)含硼化合物進(jìn)入腦腫瘤之前必須通過血腦屏障(BBB)，而BBB的存在使很多藥物的進(jìn)入都非常困難。雖然，有研究者發(fā)現(xiàn)甘露醇[28]和Cereport[29]可以破環(huán)血腦屏障，協(xié)助藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。然而，甘露醇的操作有一定的副作用，而Cereport雖然增加了BBB的滲透性，卻沒能提高BPA在腫瘤細(xì)胞上的聚集率。后續(xù)沒有看到此類報告，因此，提高含硼化合物的血腦屏障滲透性仍然是一個重要的研究方向。

6 總結(jié)與展望

作為一個新的化療體系，每一個環(huán)節(jié)都決定著最后的療效以及患者預(yù)后狀態(tài)。因此，除了前面提到的有效含硼藥物的研究開發(fā)問題，建立BNCT需要的條件設(shè)備如中子產(chǎn)生裝置和治療中硼濃度的檢測等問題都是需要設(shè)計考慮的。

在BNCT的治療過程中，國際原子能機(jī)構(gòu)對中子源有較高的要求。在1 h內(nèi)，超熱(0.5 eV～10 keV)中子流必須以大于1×109n/cm2/s的量進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，才能達(dá)到有效治療的目的。最初在布魯克哈文實驗室使用的鈾反應(yīng)堆是中子源的提供裝置，我國于 2009 年末建成了世界首座專為 BNCT 應(yīng)用且可 建在醫(yī)院內(nèi)，由醫(yī)療人員自行操控的微型核反應(yīng)堆中子源 ——醫(yī)院中子照射器(IHNI)。目前，中子發(fā)生器已經(jīng)從鈾反應(yīng)堆發(fā)展成為利用質(zhì)子加速器射出質(zhì)子與其他原子產(chǎn)生中子的加速器(accelerator-based neutron sources,ABNS)，目前日本南東北醫(yī)院的中子產(chǎn)生裝置是由京都大學(xué)和住有重工聯(lián)合研發(fā)的裝置，而這個裝置在提高BNCT的治療方面起著至關(guān)重要的作用。這個裝置主要是為了適應(yīng)臨床診斷和治療的需要，達(dá)到了安全、緊湊、穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)的要求。

除了開發(fā)高效的含硼藥物和中子加速器之外，一個很緊迫的臨床治療需求就是含硼藥物進(jìn)入人體后的實時檢測方法。含硼藥物進(jìn)入人體后到達(dá)腫瘤組織的時間、濃度和T/N比例等因素在臨床治療中非常重要。從1980年以來，人們一直用BPA-F(18F boronophenylalnine)標(biāo)記藥物并聯(lián)合PET(Postiron Emission Tomography,正電子發(fā)射計算機(jī)斷層顯像)儀器使治療過程中人體內(nèi)硼濃度得以監(jiān)測。但是這個過程需要一定時間才能完成，無法及時準(zhǔn)確地指導(dǎo)對腫瘤部位進(jìn)行照射。因此，實時檢測方法也是亟待解決地問題之一。

在這些化合物的開發(fā)研究中，大部分研究者把DNA作為目標(biāo)靶點來進(jìn)行設(shè)計。本課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，線粒體作為人體的能量中心，它的作用并不只是產(chǎn)生ATP作為能量，它是生命活動控制中心，不僅是是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且在誘發(fā)細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有至關(guān)重要的中樞調(diào)控作用。當(dāng)?shù)蛲鲂盘柋话l(fā)出時，線粒體外膜通透性增強(qiáng)，一些凋亡因子如細(xì)胞色素等由線粒體膜間隙釋放到胞漿中，啟動凋亡進(jìn)程，死亡受體途徑一旦被打通，這個進(jìn)程是不可逆轉(zhuǎn)的。當(dāng)研究的焦點是把一些代謝產(chǎn)物作為藥物靶點時，線粒體的真正功能也被忽視了。實際上隨著線粒體機(jī)制的研究深入發(fā)現(xiàn)，幾乎所有導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的因素都使線粒體結(jié)構(gòu)被破壞，發(fā)生功能障礙。究竟是哪個過程發(fā)生在前面，還是同步進(jìn)行，現(xiàn)在的研究還未能給出答案。因此我們致力于開發(fā)以線粒體為靶點的BNCT藥物開發(fā)研究。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并合成了幾類能夠進(jìn)入線粒體并產(chǎn)生抗癌效應(yīng)的小分子硼代化合物，為研究BNCT的先導(dǎo)化合物開辟一個新的方向。后續(xù)研究正在進(jìn)行中。