綠豆根腐病病原菌分離和致病力鑒定

閆強 丁佩 張勤雪

摘要：從采集自我國6個省（市）具有根腐癥狀的綠豆植株中分離得到73株分離菌株，進一步通過離體葉片接種檢測獲得54株致病菌株。通過形態學和保守序列分析共鑒定出14種致病病原菌，其中尖孢鐮刀菌檢出率最高，首次檢測出群結腐霉可以侵染綠豆并引起根腐癥狀。對來自國內外12個綠豆品種進行群結腐霉接種試驗，結果表明，群結腐霉對不同綠豆品種均表現出強致病力，病情指數在45～96之間;進一步分析表明，皖綠2號對群結腐霉表現出相對較強的抗性水平。

關鍵詞：綠豆;根腐病;病原菌分離;群結腐霉;抗病性;致病力

綠豆由于其生育期短、耐貧瘠、適應性強的特點，在用地養地及農業可持續發展等方面具有重要作用。同時綠豆是我國傳統的雜糧作物，因其經濟利用價值高，屬高蛋白、低脂肪、中淀粉、醫食同源作物，是人們理想的營養保健食品。2016年，農業部發布的《全國種植業結構調整規劃（2016—2020）》為我國雜糧小品種發展成為大產業、帶動農民增收指明了方向。2017年的“中央一號”文件也明確提出，增加我國雜糧等優質農產品供給。在政策導向、種植業結構調整以及人們飲食觀念改變的影響下，綠豆種植面積也在逐年增加，目前，我國綠豆常年種植面積超過66.67萬hm2（http：//www.moa.gov.cn/）。隨著我國綠豆種植面積的擴大、重茬和迎茬，綠豆病蟲害也隨之逐漸加劇，進而嚴重影響了綠豆產量和品質。

綠豆生育期主要病害有苗期的根腐病，花莢期的枯萎病、葉斑病、病毒病、白粉病等。其中綠豆根腐病是一種由多種病原菌混合感染引起的土傳病害，病害發生在種子萌發后整個生育階段[1-2]。2014—2015年調查發現，在黑龍江西部地區綠豆種植區根腐病發病普遍[3]，給綠豆生產帶來嚴重危害。

本研究利用形態學和分子生物學手段對綠豆根腐病致病菌進行分離、鑒定，以期為后續研究該病害的發生規律、制定綜合防治措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病樣采集和病原菌分離純化

2019年7—9月，在國家食用豆產業技術體系研究人員幫助下，分別從位于河北省石家莊市、黑龍江省齊齊哈爾市、重慶市潼南縣、遼寧省沈陽市、河南省南陽市和內蒙古呼和浩特市的綠豆種植田塊采集植株矮小，莖基部表現細縮，出現水漬、腐爛癥狀、褐色病斑的發病植株。

田間采集到的新鮮病株用自來水沖洗干凈，并用手術刀在莖基部的病健交界處切取大小約 0.5 cm×0.5 cm的組織小塊。組織樣本放入70%乙醇中處理30 s進行表面消毒，然后移入2%次氯酸鈉溶液中處理10 min，最后以滅菌水沖洗5～7遍并用滅菌濾紙吸干組織表面水分。處理好的組織放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，然后在溫度為25 ℃的培養箱中培養，待有菌落長出取邊緣菌絲純化2次后接種于PDA培養基斜面上保存。

1.2 致病性測定

從生長3周的綠豆蘇綠1號植株上選取生長狀態一致的三出復葉，切下后正面朝上置于保濕托盤中，葉柄處用濕潤脫脂棉球包裹用于保濕。葉片中心位置區域用0.05%吐溫溶液處理，消除葉片表面張力，用滅菌水沖洗后再用1mL注射器在處理區域中心位置針刺創傷。從培養4 d的菌落邊緣切取大小約4 mm×4 mm的菌絲塊，貼在上述葉片創傷處。每個分離菌株接種10張葉片。接種完畢后用保鮮膜密封保濕，置于溫度為25 ℃的培養箱中暗培養，每隔24 h觀察1次葉片發病狀況。待接種葉片發病后，根據柯赫氏法則（Koch postulates）對病原菌進行再分離。

1.3 病原菌形態學觀察

將分離得到的致病病原菌接種到PDA培養基中培養7 d，記錄菌落顏色和形態特征并拍照。挑取邊緣菌絲制作臨時切片，在光學顯微鏡（Olympus CX41）下觀察病原菌形態特征，結合菌落在PDA培養基上的形態和顏色特征，參照《真菌鑒定手冊》判定病原菌種類。

1.4 病原菌分子生物學鑒定

從培養7 d的PDA平板表面刮取病原菌菌絲，采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取病原菌總DNA[4]。分別采用rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4，β-tubulin（TUBUF2_F/TUBUF1_R），Histone 3（H3-1a/H3-1b），EF1α（EF1-728F/EF1-986R）（表1）對病原菌DNA進行PCR擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證條帶大小正確后送南京擎科生物科技有限公司測序。將測序結果在Genbank數據庫中進行blast同源比對，與已報道病原菌的核酸序列進行比較，結合形態觀察結果確定病原菌種類。

1.5 群結腐霉菌接種物制備

分離得到的群結腐霉菌（Pythium myriotylum）菌株CQ19-1（PmCQ19-1）首先在PDA培養基上活化培養4 d。接種體制備參照Kirkpatrick等的方法略加改動：從邊緣切取約1 cm×1 cm大小的菌絲塊，放置10個菌絲塊到含有滅菌細沙-玉米粉培養基（200 mL細沙，11.2 mL玉米粉，80 mL滅菌水）的500 mL三角瓶中，然后置于溫度為25 ℃培養箱中培養10 d，期間每天搖勻培養基以保證菌絲在培養基中分布均勻。收集培養物與蛭石按1 ∶ 4體積比混勻作為接種物備用[5]。

1.6 群結腐霉菌接種

綠豆接種參照Kirkpatrick等的方法：取250 mL一次性塑料杯底部打孔排水，裝入約150 mL蛭石，然后平鋪厚度為1 cm（約40 mL）的群結腐霉菌培養物[5-6]。挑選籽粒飽滿的綠豆種子每盆放置10粒于菌絲培養物表面，然后覆蓋50 mL蛭石。未培養菌絲的細沙-玉米粉培養基按同樣比例混合后作為空白對照，每個品種接種3盆。澆水至蛭石飽和后，放置于25 ℃、16 h—8 h光照—黑暗條件下培養，培養期間及時澆水保證蛭石處于水分飽和狀態。

1.7 不同綠豆品種對群結腐霉菌的抗性評價

抗病表型數據記錄采用以下方案：分別于播種后7、14 d統計植株存活率;并于14 d小心拔出植株，用自來水沖洗干凈根部蛭石，記錄不同綠豆品種的發病等級。發病分級按以下標準進行統計：（1）整個根系生長健康，無發病癥狀;（2）側根可見輕微腐爛癥狀，1%～20%的根系組織表現出癥狀;（3）側根腐爛癥狀明顯，同時主根開始表現出發病癥狀，21%～75%的根系組織表現出癥狀;（4）主根及側根均出現明顯腐爛癥狀，76%～100%的根系組織腐爛;（5）種子腐爛不萌發[6]。病情指數按以下公式計算：

病情指數=∑（各級發病株數×發病等級數值）/（植株總數×最高發病等級數值）×100。

不同品種間抗病水平差異顯著性分析采用Fisher氏最小顯著差數檢驗（LSD）法進行多重比較，顯著水平以P<0.05為基準。

2 結果與分析

2.1 病樣采集和病原菌分離

從來自6個省（市）具有根腐癥狀的綠豆植株中分離得到73株分離菌株（表2、圖1）。其中河北省石家莊市5株、黑龍江省齊齊哈爾市22株、重慶市潼南縣18株、遼寧省沈陽市14株、河南河南陽市6株、內蒙古自治區呼和浩特市8株。

2.2 病原菌致病性檢測和形態學特征

將分離得到的菌株分別接種綠豆離體葉片后，有54株分離物接種的葉片表現出發病癥狀。不同致病菌侵染綠豆葉片后病斑表型和侵染時間表現出明顯差異，發病癥狀出現在接種后1～6 d，其中分離物CQ19-01C和HNS19-02在侵染24 h后即出現明顯發病癥狀，侵染菌絲塊附近葉片出現明顯的水漬狀腐爛;而LN19-04a和LN19-04d在接種6 d后出現明顯的發病癥狀（圖2）。收集發病組織樣本對病原菌進行再分離，均獲得與接種分離物菌落形態一致的培養物，即完成柯赫氏法則（KochsPostulates）致病性檢測。

將分離得到的致病病原菌接種到PDA培養基上培養7 d后菌落形態也表現出差異（圖3）。其中檢出率最高的1種病原菌生長狀態如下：氣生菌絲濃密，絨狀，初期菌絲白色，后期菌落背面殘生淺紫色至深紫色色素（HLJ19-03b和NMGS19-02）。培養7 d后的菌落多產生小型分生孢子，卵圓或腎形，大小為（7～26）μm（平均值為12.0 μm）×（2～6）μm（平均值為4.2 μm），可初步判定為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。

2.3 病原菌分子生物學鑒定

內轉錄間隔區（ITS）和另外3個基因保守區段序列在Genbank數據庫中比對結果表明，54株致病菌共包含14種病原微生物。其中有16株是尖孢鐮刀菌，主要檢出地為齊齊哈爾市（7株）、呼和浩特市（5株）、南陽市（4株）;10株是立枯絲核菌（Rhizoctonia solani），主要檢出地為齊齊哈爾市（4株）、石家莊市（3株）和南陽市（3株）;其次是群結腐霉（Pythium myriotylum）（4株），檢出地為潼南縣（2株）、南陽市（2株）;此外還從齊齊哈爾市檢出4株木賊鐮刀菌（F. equiseti）（表3）。

從地域分布來看，在沈陽市的發病樣本分離到樹棲交鏈孢菌（Alternaria arborescens）、細極鏈格孢菌（A. tenuissima）、茄病鐮刀菌（F. solani）、螺旋木霉（Trichoderma spirale）和玉蜀黍絲核菌（Waitea circinata）等5種病原菌。在齊齊哈爾市的樣本中分離到厚孢鐮孢菌（F. chlamydosporum）、木賊鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌（F. proliferatum）等4種鐮刀菌和1種立枯絲核菌共5種病原菌。從來自南陽市的樣本中分離到立枯絲核菌、群結腐霉、尖孢鐮刀菌和Fusarium neocosmosporiellum共4種病原菌。從來自潼南縣的樣本中分離出菜豆間座殼菌（Diaporthe phaseolorum）、菜豆殼球孢菌（Macrophomina phaseolina）、群結腐霉菌等3種致病菌。從來自呼和浩特市和石家莊市的樣本中分別檢出尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌（表3）。

2.4 群結腐霉形態學特征觀察

分析鑒定結果和侵染試驗結果表明，群結腐霉為首次報道能夠侵染綠豆;同時對綠豆具有強致病性，接種離體葉片24 h后即出現明顯壞死斑，因此對該病原菌進行進一步研究。在PDA培養基上生長7 d后，群結腐霉菌絲發達，呈棉絮狀，分枝，菌絲直徑為3～11 μm（平均值為7.2 μm）;孢子囊頂生或間生寬度為9～18 μm（平均值為13 μm）;藏卵器球形或近球形，直徑為23～35 μm（平均值為29.4 μm）;游動孢子腎形，雙鞭毛（圖4）。

2.5 不同綠豆品種對群結腐霉抗病性評價

為了進一步評價群結腐霉對不同綠豆品種的致病性并為后期抗源篩選提供參考，選擇了來自11個不同省份和1個巴基斯坦的共12個綠豆品種進行抗性評價。播種后7、14 d存活率的統計結果表明，不同品種間存在明顯的抗性差異。蘇綠3號在2個調查時間點的存活率僅有13%、20%，而皖綠2號存活率分別為90%、93%，同時冀綠7號也表現出較高的存活率。病情指數的統計結果與存活率

趨勢基本一致，12個品種的病情指數在45～96之間。皖綠2號在所檢測品種中表現出最強抗性，病情指數為45，顯著低于其他品種。需要注意的是，在所選擇的12個品種中，僅有皖綠2號的病情指數在50以下，其中有5個品種的病情指數都在90以上（圖5至圖7）。

3 討論與結論

本研究通過對采集自我國6個省（市）的根腐癥狀綠豆病株進行病原菌分離，結合進一步致病性檢測獲得了54株致病菌株，形態學和保守序列分析結果表明，其屬于14種病原微生物。目前，關于綠豆根部病害的研究相對于其他大宗作物還較落后，而抗病資源和基因的挖掘則研究更少。孫菲菲對多個省份綠豆3種主要土傳病害的病原菌進行了分離鑒定，其中也分離鑒定到大量尖孢鐮刀菌菌株[7]。本研究的結果與此類似，54株中有16株是尖孢鐮刀菌，此外還有另外13株分離物屬于鐮刀菌屬。本研究對每個地區采集樣本的分離病原菌進行了分析，發現沈陽市和齊齊哈爾市檢出病原菌種類最多，而呼和浩特市和石家莊市均只檢出1種病原菌，這些信息為綠豆種植者有針對性地進行病害防治提供了相關參考。

此外，本研究還首次發現群結腐霉可以侵染綠豆并具有強致病性。群結腐霉隸屬于卵菌綱腐霉屬，在世界范圍內分布廣泛，其中許多種類是重要的土傳植物病原菌，常造成果實腐爛、根腐、莖基腐和幼苗猝倒病等多種作物病害[8]。群結腐霉作為一種土傳植物病原菌，可造成菜豆出苗前爛種和幼苗根腐[9];其引起的花生腐霉菌果腐病在一般發病田可造成產量損失達15%左右，重病田可致絕收[10];在黃姜上引起的莖基腐病造成的減產在 5%～30%之間[11];其引發的芋頭根腐病可造成 80%～100%的產量損失[12]。相關研究表明，在淹水和高濕的大豆田塊中，腐霉菌是最主要的土傳病原菌[5]。本研究對12份國內外綠豆品種抗性評價的結果也顯示，群結腐霉對綠豆具有很強的致病性，僅有皖綠2號的病情指數在50以下，其中有5個品種的病情指數在90以上。因此在我國南方或雨水較多的年份應該注意田間排水并采取積極措施，防止群結腐霉的危害。

目前，對作物根腐病主要通過應用化學藥劑進行防治，然而對群結腐霉等卵菌來講，它們不同于真菌，常見的真菌殺菌劑對其作用有限，作為土傳病原菌，在濕潤條件下使用化學藥劑較為困難，成本昂貴，而且長期使用殺菌劑會造成土壤污染、病原菌產生抗藥性、以及危害其他土壤有益生物[13]。因此，利用植物遺傳抗性仍然是控制根腐病的一種有效方式。本研究對綠豆的群結腐霉抗性評價方法和指標進行了積極探索，為后續的抗病資源篩選積累了理論基礎。

參考文獻：

[1]李 薇，臺蓮梅，郭永霞，等. 防治綠豆根腐病藥劑篩選[J]. 黑龍江八一農墾大學學報，2016，28（4）：9-11，40.

[2]曲田麗，辛惠普，李健強. 7 種殺菌劑對綠豆根腐病菌的毒力測定及增效混劑配比篩選[J]. 中國植保導刊，2011，31（7）：43-46.

[3]李季李. 黑龍江省西部地區雜糧生產情況及市場競爭力調查分析[D]. 大慶：黑龍江八一農墾大學，2015.

[4]Guo L D，Hyde K D，Liew E Y. Identification of endophytic fungi from Livistona chinensis based on morphology and rDNA sequences[J]. New Phytologist，2010，147（3）：617-630.

[5]Kirkpatrick M T，Rothrock C S，Rupe J C，et al. The effect of Pythium ultimum and soil flooding on two soybean cultivars[J]. Plant Disease，2006，90（5）：597-602.

[6]Klepadlo M，Balk C S，Vuong T D，et al. Molecular characterization of genomic regions for resistance to Pythium ultimum var. ultimum in the soybean cultivar Magellan[J]. Theoretical and Applied Genetics，2019，132（2）：405-417.

[7]孫菲菲. 三種綠豆土傳病害病原菌鑒定[D]. 北京：中國農業科學院，2017.

[8]Kamoun S，Furzer O，Jones J D，et al. The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology[J]. Molecular Plant Pathology，2015，16（4）：413-434.

[9]Rossman D R，Rojas A，Jacobs J L，et al. Pathogenicity and virulence of soilborne oomycetes on Phaseolus vulgaris[J]. Plant Disease，2017，101（11）：1851-1859.

[10]于 靜，吳菊香，許曼琳，等. 防治花生腐霉果腐病的化學藥劑篩選[J]. 中國油料作物學報，2020，42（1）：121-126.

[11]龍艷艷，劉增亮，汪 茜，等. 廣西東南沿海生姜莖腐病病原菌鑒定[J]. 西南農業學報，2017，30（3）：584-589.

[12]Tchameni S N，Cotarle M，Ghinea I O，et al. Involvement of lytic enzymes and secondary metabolites produced by Trichoderma spp. in the biological control of Pythium myriotylum[J]. International Microbiology，2020，23（2）：179-188.

[13]Tambong J T，Hfte M. Phenazines are involved in biocontrol of Pythium myriotylum on cocoyam by Pseudomonas aeruginosa PNA1[J]. European Journal of Plant Pathology，2001，107（5）：511-521. 劉加紅，盤文政，呂亞瓊，等. 具有煙草根結線蟲防效的萬壽菊秸稈生物有機肥配方及田間防控研究[J]. 江蘇農業科學，2021，49（6）：92-98.