銀杏果外種皮總黃酮提取工藝和抗氧化活性

李超峰 吳雯雯 王靖雯

摘要：以銀杏果肉質外種皮為原料、總黃酮含量為指標，采用冷凝回流法和超聲波法提取，分別以料液比、乙醇濃度、提取溫度和超聲波功率、工作時長、超聲時長為試驗單因素，確定影響提取效果的因素及其水平，通過正交法優化，確定最佳提取工藝。采用還原力與清除羥自由基、超氧陰離子自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力對總黃酮進行抗氧化活性的評價。結果表明，當超聲波功率為75 W、液料比為6 mL ∶ 1 g、乙醇濃度為70%、提取溫度為60 ℃、工作總時長為1 080 s、工作時長為3s/次和間隙時長為10 s/次時，銀杏外種皮的總黃酮提取率最高，為221%。研究還發現，銀杏果外種皮總黃酮具有良好的抗氧化活性。

關鍵詞：銀杏;外種皮;總黃酮;抗氧化活性;提取工藝

銀杏（Ginkgo biloba L.）為銀杏科銀杏屬僅有的植物，素有植物“活化石”之稱，在民間常用作中草藥。銀杏果實、葉片和樹皮均有很高的藥食價值，主要含有黃酮類、內酯類、有機酚酸類、聚戊烯醇類、多糖類等生物活性物質，其中黃酮類和內酯類是主要藥用成分[1-4]。目前，銀杏的藥用成分在臨床上主要用于治療心腦血管疾病、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎、降低血液黏度、降血脂、提高機體免疫力等方面[4-8]，因而受到廣泛關注，具有廣闊的市場前景。銀杏果外種皮是銀杏種子（白果）硬殼外的肉質部分，俗稱白果衣胞。我國在生產銀杏種核時，每年約產生4.8萬t外種皮，且常常被作為廢棄物丟棄于環境中，既浪費了資源，又造成了嚴重的環境污染。近年來的研究發現，銀杏外種皮含有多糖、酚酸、黃酮、萜內酯等多種化合物，具有較高的藥用價值[9]，因此，加大對銀杏外種皮的開發利用，可以節約有限的生物資源，減輕環境污染。

本研究采用冷凝回流提取法和超聲波法提取銀杏果外種皮總黃酮，以提取率為評價指標，在單因素試驗的基礎上采用正交試驗優化提取工藝，并明確該總黃酮的抗氧化活性。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

銀杏果于2019年10月采自鹽城師范學院校園內，去核后于-80 ℃冰箱中凍存備用。

1.2 試驗試劑

主要試劑：蕓香苷標準品，購自上海佳和生物科技有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、亞硝酸鈉（NaNO2）、硝酸鋁（AlNO3）、氫氧化鈉（NaOH）、1，10-菲咯啉、亞硫酸鐵（FeSO4）、H2O2、氯化硝基四氮唑藍（NBT）、L-蛋氨酸（L-Met）、乙二氨四乙酸二鈉（EDTA-Na2）、核黃素（VB2）、鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）、三氯乙酸、三氯化鐵（FeCl3）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、甲醇、乙醇、石油醚等其他試劑均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗儀器

電子天平，購自ME204E 瑞士梅特勒公司;勻漿機[AD145S-P（8G/10G）]，購自上海昂尼公司;索氏抽提器（SXT-06型），購自上海洪紀儀器有限公司;超聲波破碎儀（VCX150PB），購自美國SONICS公司;旋轉蒸發儀（R-210型），購自瑞士Buchi公司;真空冷凍干燥機（Labconco立式18），購自美國Labconco公司;紫外可見分光光度計（UV-2100型），購自尤尼可上海儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 銀杏果外種皮的預處理 摘取銀杏果，去除果蒂后，清洗、自然風干表皮水分，剔除果核并勻漿，再用2倍量石油醚混合，用50 ℃回流法去除脂溶性物質，剩余濾渣備用。

1.4.2 銀杏果外種皮總黃酮的提取

1.4.2.1 冷凝回流法 將10 g銀杏果外種皮經過勻漿和脫脂后，加入不同濃度和體積的乙醇溶液，并將冷凝回流提取器于不同溫度提取3 h后取出，冷卻，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至無醇味，定容至 100 mL，4 ℃保存，用于總黃酮含量的測定。根據上述單因素試驗結果，用正交試驗法對其工藝參數進行進一步優化，以明確該提取方法的最佳技術參數。

1.4.2.2 超聲波法 將10 g銀杏果外種皮經勻漿和脫脂后，按1 g ∶ 5 mL的料液比與70%乙醇溶液混合，經不同功率超聲波作用不同時間后取出，于 4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至無醇味，定容至100 mL，于 4 ℃ 保存，用于總黃酮含量的測定。根據上述單因素試驗結果，采用正交試驗法對其工藝參數進行進一步優化，以明確該提取方法的最佳技術參數。

1.4.3 總黃酮的測定 稱取蕓香苷標準品 5.00 mg，加水溶解后定容于50 mL容量瓶內，得100 mg/L蕓香苷標準溶液。分別移取2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL蕓香苷標準溶液于25.00 mL容量瓶內，定容得濃度梯度標準液的稀釋液。取 1 mL 梯度稀釋液和4.00 mL 30%乙醇溶液混合，再加入0.40 mL 5% NaNO2，搖勻靜置6 min，加入040 mL 10% AlNO3顯色劑，搖勻靜置10 min，再加入4% NaOH，搖勻靜置15 min，以不添加蕓香苷的標準溶液作為空白對照，于波長510 nm處測定吸光度。以標準溶液濃度為橫坐標、以吸光度為縱坐標建立回歸方程。按上述方法測定銀杏果外種皮提取液的吸光度，根據回歸方程計算總黃酮含量。

1.4.4 銀杏果外種皮總黃酮的抗氧化活性

1.4.4.1 還原力 按照Oyaizu的方法測定還原力[10]。取不同濃度的0.25 mL樣品，依次加pH值為6.6的0.2 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）和1% K3[Fe（CN）6]各2.5 mL，充分混勻后于50 ℃恒溫水浴20 min，取出后再加入2.5 mL 10%三氯乙酸混勻，10 000 r/min離心10 min。取5.0 mL上清液，依次加入5.0 mL H2O、1.0 mL 0.1% FeCl3，于 700 nm 處測定吸光度。

1.4.4.2 清除羥自由基 采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定清除羥自由基的能力，具體步驟參照Jin等的方法[11]，并略有改動。（1）依次取1 mL 0.75 mol/L 鄰二氮菲、2 mL 0.2 mmol/L pH值為74的PBS和1 mL ddH2O，充分混勻，再加1 mL 075 mmol/L FeSO4，混勻后加入1 mL 0.01% H2O2，于37 ℃恒溫水浴60 min，在波長536 nm處測定吸光度（Df）。步驟（2）與步驟（1）相同，僅H2O代替H2O2，吸光度記作D0。步驟（3）與步驟（1）相同，僅樣品代替ddH2O，吸光度記作Dx。步驟（4）與步驟（1）相同，僅樣品代替H2O2，吸光度記作Ds。清除羥自由基活性計算方法為：

1.4.4.3 清除超氧陰離子自由基 采用氯化硝基四氮唑藍光還原法測定清除超氧陰離子自由基的能力，具體步驟見Duan等的方法[12]，并略有改動。取5 mL含有15.6 mmol/L L-Met、0.112 5 mmol/L NBT、0.3 mmol/L EDTA-Na2和pH值為7.8的005 mol/L PBS反應混合液，對照組加入0.5 mL ddH2O，樣品本底吸收校正組和試驗組各加0.5 mL不同濃度的總黃酮提取液，3種試驗組再加1 mL VB2后，將調零組和校正組立即置于暗處，試驗組于25 ℃照光15 min后，立即遮光，在波長560 nm處測定吸光度。清除超氧陰離子活性按下式計算：

1.4.4.4 清除DPPH自由基 具體參照Manivasagan等的方法并略有改動[13]。將0.2 mL不同濃度的樣品與5 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液混合，在室溫下遮光反應30 min，于波長517 nm處測定吸光度（D）;以0.2 mL ddH2O代替樣品作為空白對照（D′），以甲醇代替含有DPPH的甲醇溶液作為樣品本底吸收校正（Dj）。清除二苯代苦味?；杂苫钚园聪率接嬎悖?/p>

2 結果與分析

2.1 冷凝回流法提取率的影響因素及其水平的確定

2.1.1 液料比對提取率的影響 由圖1可知，在乙醇濃度為70%、提取溫度為60 ℃、提取時間為3 h和液料比為1～5 mL ∶ 1 g的條件下，隨著液料比的增加，銀杏外種皮總黃酮提取率逐漸提高;當液料比從1 mL ∶ 1 g增加到2 mL ∶ 1 g時，提取率線性提高;當液料比從4 mL ∶ 1 g增加到 5 mL ∶ 1 g 時，提取率從1.22%提高到1.45%，變化平緩，僅增加023百分點。因此，綜合提取效率，選擇4 mL ∶ 1 g、 5 mL ∶ 1 g和6 mL ∶ 1 g等3個液料比水平進行正交試驗。

2.1.2 溫度對提取率的影響 如圖2所示，在提取時長為3 h、液料比為5 mL ∶ 1 g、乙醇濃度為70%、溫度為30～70 ℃的條件下，隨著提取溫度逐漸提高，總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢;當提取溫度為60 ℃時，總黃酮提取率最高，為1.49%。因此，選擇50、60、70 ℃這3個溫度水平進一步進行正交試驗。

2.1.3 乙醇濃度對提取率的影響 如圖3所示，在提取溫度為60 ℃、提取時間為3 h、液料比為 5 mL ∶ 1 g 和乙醇濃度為60%～100%的條件下，隨著乙醇濃度的提高，總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢。當乙醇濃度為80%時，總黃酮提取率最高，為1.73%。因此，選擇70%、80%、90% 3個水平的乙醇濃度進一步進行正交試驗。

2.1.4 正交優化 冷凝回流法正交試驗因素與水平設計見表1，正交試驗結果見表2。由極差大小可知，3個因素對提取率的影響程度依次為液料比（C）>乙醇濃度（A）>溫度（B）。均值代表了每個因素的最佳水平條件，對同一因素的3個水平進行比較可知：A1>A3>A2，B2>B3>B1，C3>C2>C1，因此，在該冷凝回流試驗中，A1B2C3組成了最優水平，即在冷凝回流提取中，乙醇濃度為70%，提取溫度為60 ℃，液料比為6 mL ∶ 1 g。

2.2 超聲波法提取率的影響因素及其水平的確定

2.2.1 工作總時長對提取率的影響 由圖4可知，在超聲波功率為150 W、工作時長為3 s/次、間隙時長為10 s/次、乙醇濃度為70%和液料比為5 mL ∶ 1 g的條件下，隨著工作總時長的增加，銀杏外種皮總黃酮提取率基本呈升高趨勢。當超聲波工作總時長為 900 s 時，總黃酮提取率最高，為 1.47%。因此，選擇720、900、1 080 s 3個水平的超聲波工作總時長進行正交試驗。

2.2.2 工作時長對提取率的影響 由圖5可知，在工作總時長為360 s、功率為150 W、間隙時長為 10 s/次、乙醇濃度為70%和液料比為5 mL ∶ 1 g的條件下，隨著超聲波工作時長的延長，銀杏外種皮的總黃酮提取率呈“S”形趨勢。當超聲波工作時長為4 s/次時，總黃酮提取率最高，為0.78%。因此，選擇3、4、5 s/次3個水平的超聲波工作時長進行正交試驗。

2.2.3 功率對提取率的影響 由圖6可知，在工作總時長為360 s、超聲波工作時長為3 s/次、間隙時長為10 s/次、乙醇濃度為70%和液料比為5 mL ∶ 1 g的條件下，隨著超聲波功率的提高，銀杏外種皮的總黃酮提取率呈先升高后降低的趨勢。當超聲波功率為60 W時，總黃酮提取率最高，為1.40%。因此，選擇45、60、75 W 3個水平的超聲波功率進行正交試驗。

2.2.4 正交優化 超聲波正交試驗因素與水平設計見表3，正交試驗結果見表4。由極差大小可知，3個因素對提取率的影響程度依次為超聲波功率（E）>工作時長（F）>總時長（D）。均值代表了每個因素的最佳水平條件，對同一因素的3個水平進行比較可知：D3>D2>D1，E3>E2>E1，F1>F2>F3。因此，在該冷凝回流試驗中，D3E3F1組成了各因素最優水平，即在超聲波提取過程中，工作總時長為 1 080 s，功率為75 W，工作時長為3 s/次。

將優化后的提取條件相結合，在液料比為 6 mL ∶ 1 g、乙醇濃度為70%、提取溫度為60 ℃、超聲波功率為75 W、工作總時長為1 080 s、工作時長為3 s/次和間隙時長為10 s/次的條件下，外種皮總黃酮的提取率為2.21%。因此可見，與單一提取法相比，2種方法結合的效果較好，既可以提高銀杏外種皮總黃酮的提取率，又可以縮短提取時間，提高效率，更有利于工業化生產。

2.3 總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 還原力 物質的還原能力是潛在抗氧化性能的重要體現[14]。如圖7所示， 隨著濃度的提高，銀杏果外種皮總黃酮的還原力逐漸增強，且在試驗濃度范圍內，二者呈線性正相關，相關系數為0969 4，回歸方程為y=0.000 3x+0.208 4。

2.3.2 清除羥自由基活性 羥自由基是已知活性最強、危害最大的活性氧，對脂類、蛋白和核酸等生物大分子具有強烈的氧化脅迫作用，使其正常生理功能難以進行，進而產生畸變，甚至可累積致死[15]。由圖8可以看出，在濃度為0.2～0.8 g/L的范圍內，銀杏果外種皮總黃酮清除羥自由基的活性逐漸升高，清除率最高達59.13%;而當濃度為1.0 g/L時，其活性略有降低，清除率為57.85%。

2.3.3 清除超氧陰離子自由基活性 超氧陰離子活性相對較低，但卻是生物體內羥自由基、過氧化氫等其他自由基形成的基礎，它們均由超氧陰離子自由基衍生而來[16]。同時，超氧陰離子自由基可以使DNA損傷，進而引發突變，也可以使過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶、肌酸激酶失活，從而對生物產生毒害作用[17]。由圖9可知，隨著濃度的提高，銀杏果外種皮總黃酮清除超氧陰離子的活性逐漸增強，且在0.2～1.0 g/L范圍內二者呈線性正相關，相關系數為0.990 5，回歸方程為y=0.046 8x+7238 3。

2.3.4 清除DPPH自由基活性 自由基與衰老、心血管疾病、癌癥、糖尿病、帕金森綜合癥等多種疾病發生有著潛在聯系[18]。DPPH自由基結構簡單、性質穩定、反應易于控制，是抗氧化劑自由基清除活性篩選的首選試劑[19]。由圖10可知，銀杏外種皮總黃酮具有清除DPPH自由基的能力，且在試驗條件下，清除DPPH自由基的活性與濃度呈線性正相關，相關系數為0.972 2，回歸方程為y=0.027 6x+42.258 0。

3 結論

在上述單因素研究的基礎上，結合正交試驗分析，確定了相應的工藝條件。在超聲波功率為 75 W、液料比為6 mL ∶ 1 g、乙醇濃度為70%、提取溫度為60 ℃、工作總時長為1 080 s、工作時長為 3 s/次、間隙時長為10 s/次的條件下，銀杏果外種皮的總黃酮提取率為2.21%。此外，銀杏果外種皮總黃酮具有較強的抗氧化活性，對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基都具有顯著的清除活性。研究結果為新一代安全抗氧化等產品的開發及銀杏加工廢棄物的高值化利用提供了有益參考，具有重要的經濟和理論意義。

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