兒童哮喘持續狀態和間質性肺疾病的相關性

易繪 梁亞勇 肖奕青 蔣卡麗

【摘要】 目的：研究兒童哮喘持續狀態和間質性肺疾病（ILD）的相關性。方法：選取2015年10月-2017年10月本院收治的20例兒童哮喘持續狀態合并ILD患兒（A組），20例單純哮喘持續狀態患兒（B組），20例單純ILD患兒（C組）和于本院體檢的20例健康兒童（D組）。采用流式細胞術檢測四組外周血Th1/Th2，ELISA法檢測四組外周血hs-CRP、IL-7樣細胞因子（TSLP）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）及抗Jo-1抗體水平。結果：A、B組Th1和Th1/Th2均明顯低于C、D組，且Th2均高于C、D組（P<0.05）。A組Th1和Th1/Th2均明顯低于B組，且Th2明顯高于B組（P<0.05）。C組Th1和Th1/Th2均明顯高于D組，且Th2明顯低于D組（P<0.05）。A、B、C組hs-CRP和TSLP水平均高于D組，其中A組>B組>C組（P<0.05）。A、B、C組MCP-1與抗Jo-1抗體均高于D組，其中A組>C組>B組（P<0.05）。結論：兒童哮喘持續狀態和ILD關系密切，Th1/Th2平衡調節可能是兩者關聯的重要機制，可作為兩種疾病的內在機制和治療靶點研究的參考依據。

【關鍵詞】 哮喘持續狀態 間質性肺疾病 Th1/Th2 hs-CRP IL-7樣細胞因子 單核細胞趨化蛋白-1 抗Jo-1抗體

[Abstract] Objective： To study the correlation between status asthmaticus and interstitial lung disease （ILD） in children. Method： A total of 20 children with status asthmaticus combined with ILD （group A）， 20 children with status asthmaticus alone （group B）， 20 children with ILD alone （group C） and 20 healthy children （group D） admitted to our hospital from October 2015 to October 2017 were selected. The levels of Th1/Th2 in peripheral blood of the four groups were detected by flow cytometry， and the levels of hs-CRP， IL-7-like cytokines （TSLP）， monocyte chemotactic protein-1 （MCP-1） and anti-Jo-1 antibody in peripheral blood of the four groups were detected by ELISA. Result： Th1 and Th1/Th2 in groups A and B were significantly lower than those in groups C and D， and Th2 was higher than those in groups C and D （P<0.05）. Th1 and Th1/Th2 in group A were significantly lower than those in group B， and Th2 was significantly higher than that in group B （P<0.05）. The Th1 and Th1/Th2 in group C were significantly higher than those in group D， and the Th2 in group C was significantly lower than that in group D （P<0.05）. The levels of hs-CRP and TSLP in groups A， B and C were higher than those in group D， among which group A > group B > group C （P<0.05）. MCP-1 and anti-Jo-1 antibodies in groups A， B and C were higher than those in group D， among which group A > group C > group B （P<0.05）. Conclusion： The children with status asthmaticus is closely related to ILD， and the regulation of Th1/Th2 balance may be an important mechanism of the association between the two diseases， which can be used as a reference for the study of the internal mechanisms and therapeutic targets of the two diseases.

[Key words] Status asthmaticus Interstitial lung disease Th1/Th2 hs-CRP IL-7 like cytokine Monocyte chemoat-tractant protein-1 Anti-Jo-1 antibody

研究認為，兒童哮喘是Th1/Th2平衡失衡，Th2炎癥占優勢的氣道炎癥[1]。IL-7樣細胞因子（TSLP）在哮喘的發生和發展中起重要作用，可通過上調Th2細胞表達，使Th1/Th2平衡向Th2傾斜[2]。哮喘持續狀態是較嚴重的哮喘形式，是外界環境（粉塵或屋塵螨）與自身免疫系統紊亂共同參與的結果[3]。據統計，兒童哮喘持續狀態并發間質性肺疾病（ILD）的發生率逐漸增加，我國每年新診斷兒童哮喘（200～350）萬，其中3%～10%可并發ILD[4]。ILD是以彌漫性滲出和氣體交換障礙為特點的慢性肺疾病，發病機制較為復雜，但多數學者認為，自身免疫功能障礙導致肺部損傷起重要作用[5]。目前關于兒童哮喘持續狀態與ILD的相關研究還較少，基于此，本研究通過分析有關的免疫活性細胞或因子的表達水平，解釋可能的作用機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年10月-2017年10月本院收治的20例兒童哮喘持續狀態合并ILD患兒（A組），20例單純哮喘持續狀態患兒（B組），20例單純ILD患兒（C組）和于本院體檢的20例健康兒童（D組）。診斷標準：兒童哮喘診斷參照全球哮喘防治倡議（GINA）標準;ILD診斷參照2002年美國胸科學會（ATS）和歐洲呼吸學會（ERS）的臨床、病理和放射學標準。納入標準：年齡5～14歲;符合上述診斷標準。排除標準：先天發育異常、遺傳代謝性疾病;明顯病因的ILD;其他類型的自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡。所有患兒家屬均知情同意并簽署知情同意書，本研究已經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 采用流式細胞術檢測各組外周血Th1/Th2。流式細胞術主要試劑和儀器：淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制劑有限公司），Anti-Human IL-4 PE、Anti-Human y-IFN PE、Anti-Human CD4 FITC（eBioscience，San Diego，CA）。流式細胞儀（美國Beckman Coulter有限公司）。（1）標本采集：清晨空腹采集肘靜脈血5 mL，2 h內2 000 r/min離心10 min，取上清-20 ℃保存待檢細胞因子。余血液采用密度梯度離心法2 000 r/min離心20 min，分離外周血單個核細胞（PBMC），8 h內上機做流式細胞檢測Th1/Th2。（2）PBMC分離：利用淋巴細胞分離液分層后，中間白色云霧狀為PBMC。（3）PBMC鋪板和活化：顯微鏡下調整濃度為2×106/mL，依次加入新鮮配制的佛波酯（PMA，50 ng/mL），離子霉素（2 μg/mL），布雷菲得菌素（BFA，3 μg/mL），取懸液至24孔細胞培養板內，37℃ 5%CO2培養箱中孵育5 h。（4）Th1和Th2細胞表面和胞內抗體標記：取2個1.5 mL流式管重懸，標記為A和B，A為實驗管，B為對照組管。加1 mL PBS、1 500 r/min離心5 min、棄上清;分別加入抗人CD4-FITC 5 μL，對細胞膜表面CD4分子進行特異性染色，室溫避光孵育30 min;加1 mL PBS、1 500 r/min離心5 min、棄上清;加100 μL Th1或Th2細胞專用固定劑A（FIX&PERM A），室溫避光孵育15 min;加1 mL PBS、1 200 r/min離心5 min、棄上清;加100 μL Th1或Th2細胞專用固定劑B（FIX&PERM B），室溫避光孵育20 min;加1 mL PBS、1 200 r/min離心5 min、棄上清;于A管中加5 μL抗人γ-IFN-PE單抗或IL-4-PE單抗，對細胞內γ-IFN或IL-4進行染色，B管中加5 μL抗鼠PE-anti-IgG1抗體，室溫避光孵育20 min;加1 mL PBS、1 200 r/min離心5 min、棄上清。調整細胞濃度為105/mL做流式分析，采用cellQuest分析軟件計算結果。ELISA法檢測各組hs-CRP、IL-7樣細胞因子（TSLP）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）及抗Jo-1抗體的表達水平，試劑購自美國R&D公司，嚴格按照說明書步驟進行，分別測量3次取平均值。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，四組比較采用單因素方差（ANOVA）分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組一般資料比較 A組男12例，女8例;年齡6～14歲，平均（9.1±2.3）歲;B組男11例，女9例;年齡5～13.3歲，平均（9.3±2.0）歲;C組男10例，女10例;年齡6.5～13.5歲，平均（9.2±2.4）歲;D組男11例，女9例，年齡6～14歲，平均（9.4±2.1）歲。四組一般資料比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 四組Th1、Th2及Th1/Th2比較 四組Th1、Th2及Th1/Th2比較，差異均有統計學意義（F=8.163、15.207、5.482，P<0.001）。A、B組Th1和Th1/Th2均明顯低于C、D組，且Th2均高于C、D組，差異均有統計學意義（P<0.05）。A組Th1和Th1/Th2均明顯低于B組，且Th2明顯高于B組，差異均有統計學意義（P<0.05）。C組Th1和Th1/Th2均明顯高于D組，且Th2明顯低于D組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3 四組hs-CRP和TSLP水平比較 四組hs-CRP和TSLP水平比較，差異均有統計學意義（F=9.527、12.624，P<0.001）。A、B、C組hs-CRP和TSLP水平均高于D組，其中A組>B組>C組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4 四組MCP-1和抗Jo-1抗體水平比較 四組MCP-1和抗Jo-1抗體水平比較，差異均有統計學意義（F=8.457、16.629，P<0.001）。A、B、C組MCP-1與抗Jo-1抗體均高于D組，其中A組>C組>B組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

小兒哮喘發生的機制可能是T淋巴細胞和肥大細胞、嗜酸性粒細胞誘導的一系列免疫反應。樹突狀細胞（DCs）與外來抗原相互作用是過敏反應是否發生的關鍵步驟[6]。DCs俘獲外來抗原提呈至肺淋巴結的T淋巴細胞，T淋巴細胞對抗原的反應依賴于抗原的形狀以及DCs的狀態。一方面，如果DCs被炎癥信號預刺激后，模式識別受體改變，主動辨認抗原，產生IL-12因子并將抗原提呈給Th1細胞并分泌IL-2、INF-γ等細胞因子，最終誘導免疫耐受[7]。另一方面，如果DCs沒能產生IL-12信號，則Th2細胞分化應答，分泌IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子[8]。當再次遇到相同抗原時，作為免疫記憶的Th2細胞產生一系列的免疫反應，表現為過敏反應。因此，哮喘的發生很可能是機體Th1和Th2平衡被打破，Th1產生減少，Th2產生增多[9]。但ILD的發病機制與哮喘完全不同，研究顯示，ILD發病過程中Th1細胞數量及其細胞功能占優勢，Th1細胞過度分泌和釋放的細胞因子可介導肺組織損傷，而持續性的肺損傷可誘導肺組織異常修復，引發肺纖維化[10]。相關動物模型證實，肺纖維化大鼠經硫化氫干預后可抑制核轉錄因子kappaB（NF-κB）信號通道表達，能減輕炎性細胞浸潤和肺纖維化，并使Th1/Th2平衡向Th2細胞傾斜[11]。本研究結果顯示，A、B組Th1和Th1/Th2均明顯低于C、D組，且Th2均高于C、D組（P<0.05）;A組Th1和Th1/Th2均明顯低于B組，且Th2明顯高于B組（P<0.05）;C組Th1和Th1/Th2均明顯高于D組，且Th2明顯低于D組（P<0.05），表明哮喘持續狀態與ILD均存在免疫調節紊亂，哮喘中Th2細胞占優勢，而ILD中Th1細胞占優勢。A組hs-CRP和TSLP水平均顯著高于其他組，提示哮喘持續狀態合并ILD會加重機體免疫調節紊亂和炎癥反應，并向Th2細胞偏移。筆者推測，哮喘與ILD可能存在某種相互協同作用。持續性哮喘引起的氣道炎癥加重，會釋放過量的IL-4、IL-13等炎癥因子介導氣道結構破壞，導致氣流受阻，肺功能降低，肺部組織供氧缺少，并進一步介導肺部炎癥反應，誘導CD4+淋巴細胞應答增強，并使Th0細胞向Th2細胞分化，造成Th2細胞優勢。而ILD的發病中雖然Th1細胞占優勢，但在哮喘發病中Th2細胞分泌的大量細胞因子可抑制Th0細胞向Th1細胞轉化，并抑制Th1細胞功能。當然，兩者的相互作用機制仍有待進一步證實。

ILD的病變涉及肺泡間隔、支氣管、血管、末梢氣腔隙周圍的肺間質、肺泡腔和細支氣管腔等，兒童ILD的病因、臨床表現和治療效果均與成人不同[12]。抗Jo-1抗體是抗氨基酰-tRNA合成酶抗體，被認為ILD的標志性抗體。抗Jo-l抗體可參與肺部免疫復合物的形成，觸發肺巨噬細胞活性，釋放趨化因子，募集其他的炎性反應成分，從而導致肺損傷[13]。MCP-1是趨化因子家族中C-C亞族中的成員，具有單核細胞趨化活性，在ILD肺組織中，MCP-1表達于上皮細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞，在單核巨噬細胞介導的炎癥過程中起重要作用[14-18]。本研究結果顯示，A、B、C組MCP-1與抗Jo-1抗體均高于D組，其中A組>C組>B組（P<0.05），提示哮喘持續發作會加重ILD病情，印證了以上筆者推測。臨床研究證實，臨床中針對哮喘持續狀態合并ILD患者采用合適的激素方案，有效率50%～75%，哮喘癥狀緩解同時，肺部損傷程度也明顯減輕，進一步說明哮喘與ILD存在密切關系[19-20]。

綜上所述，兒童哮喘持續狀態和ILD關系密切，Th1/Th2平衡調節可能是兩者關聯的重要機制，可作為兩種疾病的內在機制和治療靶點研究的參考依據。

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（收稿日期：2020-06-10） （本文編輯：田婧）