血清miR-144、miR-518b和ACR在早期診斷妊娠期高血壓腎功能損害中的應用價值

陳凌霞

妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是產科的常見病和多發病，其發病率高達5%～8%，臨床上的表現以高血壓，蛋白尿，水腫和腎功能發生損害為主要特點；HDCP還會增加妊娠期間不良結局的發生風險，嚴重威脅著母嬰的安全，是孕產婦和圍產兒發生死亡的主要原因[1,2]。HDCP合并腎損傷常常無明顯的臨床表現，血肌酐和尿素氮大多數正常。目前，24 h尿蛋白定量與尿肌酐的比值(ACR)來診斷腎損傷，然而其靈敏度和特異性仍不高，因此，尋找早期診斷HDCP腎損傷的標記物尤為重要。微小RNA(miRNA)通過調控轉錄水平的基因翻譯，參與了胚胎的發育，細胞的增殖和分化，在妊娠高血壓的形成過程中具有重要的臨床意義[3]。本組研究發現聯合檢測miR-144，miR-518b和ACR在HDCP腎損傷的診斷具有重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017至2018年在我院就診的HDCP患者118例為HDCP組，年齡24～39歲，平均年齡(31.91±2.61)歲；孕周24～35周，平均孕周(30.94±0.86)周；孕次1～4次，平均(1.84±0.46)次。根據病情不同分為妊娠高血壓組(n=44)，子癇前期輕度組(n=36)和子癇前期重度組(n=38)；根據腎小球濾過率(eGFR)分為腎功能正常組(≥80 ml/min，n=72)和腎功能異常組(<80 ml/min，n=46)。根據KDIGO制定急性腎損傷的標準將腎功能異常組分為1期17例，2期15例和3期14例。選擇同期在我院體檢的正常孕婦45例為正常妊娠組，年齡24～39歲，平均年齡(32.37±3.17)歲；孕周24～35周，平均孕周(29.46±0.93)周；孕次1～4次，平均(1.79±0.35)次。選擇同期在我院行健康體檢女性30例為健康對照組，其中年齡24～39歲，平均年齡(32.37±2.46)歲。HDCP組、正常妊娠組、健康對照組年齡等基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：均簽署知情同意書，經醫院倫理委員會審核通過；妊娠女性均為單胎。

1.2.2 排除標準：急性和慢性感染性疾病；血液性和免疫性疾病；惡性腫瘤；心肝腎等重要臟器功能障礙；智力障礙和精神疾病。

1.3 方法

1.3.1 血液標本和尿液標本采集和檢測:患者入院后清晨空腹肘靜脈血約10 ml，在4℃的條件下放置30 min，低速離心20 min，離心速度1 800 r/min，離心半徑為15 cm，離心后去上清液，將其保存在-70℃冰箱中保存。另外收集患者早晨中段尿液5 ml，采用3 000 r/min的離心速度，離心10 min，選取上清液，放置在-70℃冰箱待測。采用免疫比濁法測點尿微量蛋白(mALB)，采用沒法檢測肌酐。

1.3.2 miRNA提取和逆轉錄反應:根據miRNeasy提取試劑盒的說明書提取miRNA，并通過紫外分光度將吸光度的比值在1.8～2.0的標本保存用于后續檢測，保存在-70℃的冰箱中。按照miRNA反轉錄試劑盒的使用說明書將miRNA反轉錄為cDNA，標本保存在-70℃的冰箱中。

1.3.3 qRT-PCR檢測:根據GenBank中的miR-144，miR-518b和U6的序列號，用Premier Primer5.0軟件進行引物設計，并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成引物。miR-144引物序列，上游：5’-GGGAGATCAGAAGGTGATF-3’，下游：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，miR-518b的引物序列，上游：5’-GCAAAGCGCTCCCCTTTAG-3’，下游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和U6引物序列，上游：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。qRT-PCR總反應體系為25 μl，包括上下游引物各1.0 μl(濃度10 μmmol/L)，cDNA為0.8 μl，RNaseH2O為 12.2 μl和SYBRPPrimix Ex TaqTM 10 ml。反應條件為：預變性溫度95℃ 10 min，95℃和60℃分為5 s和60 s，總共進行40個循環。在60℃下用ABI7700軟件收集熒光信號進行溶解曲線分析，每個樣品進行3個平行復孔，相對表達量采用表示2-ΔΔCt，公式表達為ΔΔCt=實驗組(Ct目標基因-CtU6)-對照組(Ct目標基因-CtU6)。

1.4 觀察指標 比較不同類別、不同程度3組血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平，與HDCP嚴重程度，HDCP腎損害和腎損害嚴重程度的關系，及其在HDCP腎損傷中的診斷效能。

2 結果

2.1 3組血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平比較 HDCP組的miR-144表達明顯低于正常妊娠組和健康對照組(P<0.01)，而正常妊娠組明顯低于健康對照組(P<0.01)；HDCP組的miR-518b、ACR和mAlb水平明顯高于正常妊娠組和健康對照組(P<0.01)，而正常妊娠組明顯高于健康對照組(P<0.01)。見表1。

表1 3組血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平比較

2.2 血清miR-144，miR-518b，ACR和mAlb水平與HDCP嚴重程度的關系 血清miR-144表達水平子癇前期重度組明顯低于子癇前期輕度組和妊娠高血壓組(P<0.01)，并且子癇前期輕度組明顯低于妊娠高血壓組(P<0.01)；而血清miR-518b表示，ACR和mAlb水平子癇前期重度組明顯高于子癇前期輕度組和妊娠高血壓組(P<0.01)，并且子癇前期輕度組明顯高于妊娠高血壓組(P<0.01)。見表2。

表2 血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平與HDCP嚴重程度的關系

2.3 血清miR-144，miR-518b，ACR和mAlb水平與HDCP腎功能損害的關系 腎功能異常組的血清miR-144表達明顯低于腎功能正常組(P<0.01)，而腎功能異常組血清miR-518b，ACR和mAlb水平明顯高于腎功能正常組(P<0.01)。見表3。

表3 血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平與HDCP腎功能損害的關系

2.4 血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平與HDCP腎功能損害嚴重程度的關系 血清miR-144表達隨著HDCP腎功能損害分期升高而降低(P<0.01)，而miR-518b，ACR和mAlb水平隨著腎功能損害分期的升高而升高(P<0.01)。見表4。

表4 血清miR-144、miR-518b、ACR和mAlb水平與HDCP腎功能損害嚴重程度的關系

2.5 血清miR-144，miR-518b和ACR在診斷HDCP腎功能損害的效能 miR-144(Z=3.212，P<0.01)，miR-518b(Z=2.332，P<0.05)和ACR(Z=2.722，P<0.01)在診斷HDCP腎功能損害具有較高的效能明顯優于mALB，而miR-144，miR-518b和ACR指標之間差異無統計學意義(P>0.05)。將miR-144， miR-518b和ACR指標進行二元logistics分析的方差-2.687×XmiR-144+35.277×XmiR-518b+0.077×XACR-32.109得出聯合檢測指標，聯合檢測的靈敏度為100%，特異性為86.1%，曲線下面積為0.980明顯優于單個指標miR-144(Z=3.425，P<0.01)，miR-518b(Z=3.817，P<0.01)和ACR(Z=3.592，P<0.01)。見表5，圖1。

表5 miR-144，miR-518b和ACR在診斷妊娠期高血壓疾病腎功能損害的效能

圖1 miR-144、miR-518b和ACR在診斷妊娠期高血壓疾病腎功能損害的效能

3 討論

HDCP與原發性高血壓的發病機制并不相同，孕婦的免疫功能異常是疾病發生的重要原因，是導致孕產婦和圍產兒死亡的重要原因之一。腎臟是HDCP攻擊的主要靶器官，其主要機制是通過誘導腎小球壓力升高，損害內皮細胞的功能，誘發一系列細胞因子釋放，最終導致腎臟功能受損[3]，直接影響血管活性物質的調節和體液平衡，引起機體代謝障礙，增加高血壓的病情，加重腎功能損傷，甚至出現尿毒癥[6,7]。因此，早期對腎功能損傷進行早期診斷，并有效干預，是最大程度降低圍產期母嬰死亡率的關鍵。傳統的診斷腎功能損害指標如肌酐和尿素氮在腎功能損害的早期，并不能出現明顯改變，因為腎臟具有較大的儲備功能，只有當腎小球濾過率降低>50%才能出現明顯的改變。尿微量白蛋白是腎臟早期損害指標，由于其帶負電荷，不能通過腎小球的濾過膜，因此在正常情況下尿液中甚微。肌酐是長期以來用于評價腎功能的指標，但在診斷HDCP腎功能損害方面存在靈敏度和特異性并不高，而ACR更能準確反映HDCP早期腎功能損傷，其具有簡單方便，患者依從性好，并在HDCP腎功能損害的早期診斷中逐漸代替24 h蛋白尿[8,9]。本組研究顯示HDCP患者ACR水平明顯高于正常妊娠和健康對照組，與文獻報道的結果[10,11]一致，并且發現隨著HDCP嚴重程度的升高而升高，發現腎臟功能異常患者ACR水平明顯高于腎功能正常患者，并隨著腎功能分期的升高而升高，與文獻報道的結果[12]類似，說明ACR水平與HDCP腎功能損傷具有一定的聯系。在診斷HDCP腎功能損害方面，ACR>135.13時，其靈敏度為89.1，特異性為68.1，AUC為0.860明顯高于單個指標mALB的診斷，但其在診斷HDCP腎損傷也有一定的局限性，其穩定性受到年齡，飲食，炎癥和體內蛋白代謝的影響，因此，ACR在診斷HDCP腎損傷受到生理性蛋白尿的干擾。

miRNAs是一類有22個核苷酸左右組成的非編碼RNA，其在轉錄和翻譯水平進行基因調控，參與了疾病的發生發展。可以通過與靶基因的mRNA的非編碼取結合，降解或者抑制靶基因的蛋白的翻譯，從而達到基因表達的調控，在早期滋養葉細胞腎臟和發育中起到重要作用[13]。miR-144現有的研究主要集中在腫瘤的診斷和預后的研究，miR-144在胃癌，腸癌和子宮頸癌等呈低表達，并且與預后密切相關[14-16]。在良性疾病的研究中主要集中在糖尿病和高血壓，發現miR-144的表達與吸煙具有明顯相關性[17,18]，是發生糖尿病的危險因素。在妊娠方面報道較少，本組研究發現HDCP患者血清miR-144表達水平明顯低于正常妊娠組和健康對照組，并且隨著HDCP嚴重程度的升高而降低，說明miR-144參與了HDCP疾病的發生發展，并且是其保護因子，HDCP越嚴重，其表達越低。本組研究發現腎功能異常患者血清miR-144表達水平明顯低于腎功能正常組，并且發現隨著腎功能分期升高而出現血清miR-144表達明顯降低，說明miR-144是HDCP的保護因子。在診斷HDCP腎功能損害方面，當血清miR-144表達≤2.164時，其靈敏度82.6%，特異性80.6%，AUC為0.882，明顯高于mALB，說明在診斷HDCP腎功能損害方面具有較高的診斷效能。miR-518b是定位于人類19號染色體，主要在生殖系統和胎盤組織中表達，其表達在物種之間具有高度保守性，對組織具有特異性，在胎盤組織具有較高的表達[19]。在一組基因芯片技術分析發現miR-518b具有胎盤組織特異性，主要由胎盤絨毛膜滋養細胞分泌，并進入血液循環，并與胎盤的狀態具有明顯的相關性[20]。本組研究發現HDCP組血清miR-518b表達水平明顯高于正常妊娠組和健康對照組，并且與HDCP疾病的嚴重程度呈正相關，說明miR-518b參與了妊娠高血壓疾病的發生發展過程。本組研究還發現HDCP腎功能異常患者血清miR-518b表達水平明顯高于腎功能正常組，并且隨著腎功能分期升高而升高，在診斷腎功能異常方面具有較高的特異性和靈敏度，當機體血清miR-518b>0.759時，其靈敏度為78.3%，特異性84.7%，AUC為0.845明顯高于mALB，說明血清miR-518b表達在診斷HDCP腎功能異常具有較高的診斷效能。本組研究發現miR-144， miR-518b 和 ACR在診斷HDCP腎功能異常的診斷效能明顯優于mALB，而miR-144， miR-518b 和 ACR之間的診斷效能無明顯差異，聯合miR-144， miR-518b 和 ACR 3個指標形成聯合檢測，其靈敏度為100%，特異性為86.1%，AUC明顯高于miR-144， miR-518b 和 ACR，說明三者聯合檢測能夠明顯提高診斷HDCP腎功能損害的診斷效能，，miR-144， miR-518b 和 ACR三者之間是否存在某種聯系或者某種平衡，其確切機制需要進一步研究。

總之miR-144和miR-518b參與了HDCP腎損害的發生發展，血清miR-144，miR-518b和ACR檢測在早期診斷HDCP腎功能損害具有較高的效能，聯合檢測優于單個指標。