痰標本熒光定量聚合酶鏈反應法結核桿菌檢測在肺結核患者診斷中的應用

河南省洛陽市疾病預防控制中心（471023）趙衛 劉萌萌

肺結核為結核分枝桿菌感染所致常見慢性病，近年來其發病率持續增高，對患者身心健康及生活質量影響極大，同時，我國為結核病多發國家之一，及早確診肺結核并有針對性給予對應干預措施有利于改善疾病整體療效與預后效果。此外，由于免疫抑制劑廣泛應用、基礎病變及多重耐藥等可造成結核病再現，故臨床急需加強結核桿菌早期迅速檢測，避免延誤患者最佳治療時機。既往臨床用于肺結核結核桿菌的病原學檢測方式主要包括培養法及痰涂片法，前者為疾病診斷金標準，但用時較長、操作繁瑣，而痰涂片法特異性及檢出率均較低[1]。FQ-PCR也是肺結核重要診斷措施，其具有較高特異性及敏感度，可檢測出1～100fg純化結核分枝桿菌DNA，逐漸在疾病診療中發揮重要作用[2]。基于此，本研究選取肺結核患者103例，探討FQ-PCR應用價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我中心2 0 1 7 年6月～2018年12月肺結核患者103例設為研究組，同期103例非肺結核患者設為對照組。研究組男61例，女42例；年齡46～68歲，平均（57.06±5.03）歲。對照組男59例，女44例；年齡47～70歲，平均（57.64±4.91）歲；疾病類型：氣胸2例，膿胸3例，支氣管擴張癥22例，真菌性肺炎4例，細菌性肺炎72例。兩組基線資料均衡可比（P＞0.05）。

1.2 選取標準

1.2.1 納入標準 ①首次發病；②均經病理檢查確診；③知曉本研究，簽署同意書；④研究組經CT或胸片檢查可見肺結核征象。

1.2.2 排除標準 ①合并全身性重度感染性病變者；②合并其他肺部病變者；③合并腎肝等臟器器質性病變者；④合并免疫系統、血液系統病變者；⑤合并代謝系統病變者。

1.3 方法 漂浮集菌涂片法：采集患者24h痰液（即時痰、晨痰、晚痰），置于2倍體積無菌蒸餾水內，常規實施20min高壓蒸汽滅菌，置入0.3ml二甲苯，震蕩約10min后加滿無菌蒸餾水，15min靜置，取帶有血清玻片覆蓋于瓶口后靜置約15min，去掉載玻片，干燥處理，實施萋-尼氏抗酸染色及鏡檢分級。FQ-PCR法：取痰標本，置入等量胰蛋白酶（濃度：1%），混合均勻，取0.5ml離心（10000r/min，5min）處理，留沉淀置入生理鹽水1ml實施重懸，2次離心洗滌；DNA擴增模板制備：沉淀加入試劑盒DNA，取50ul混合均勻，煮沸約10min后靜置裂解菌體6h，離心（10000r/min，5min）處理，取2ul上清液作模板，依據試劑盒說明書所提供反應條件實施DNA擴增，93℃條件下2min預變性，55℃條件下45s、93℃條件下45s，擴增10個循環，隨后采取55℃ 45s及93℃ 45s擴增30個循環，取陽性及陰性質控品作參照，若拷貝數＞50則評定為陽性。

1.4 觀察指標 ①漂浮集菌涂片法及FQPCR法對肺結核檢查結果。②漂浮集菌涂片法及FQ-PCR法對肺結核診斷效能。

1.5 統計學方法 通過SPSS25.0對數據進行分析，計數資料采取n（%）表示，χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 漂浮集菌涂片法及FQ-PCR法檢查結果 經FQ-PCR法檢查可知研究組陽性率為（98.06%）、對照組陰性率為（97.09%），經漂浮集菌涂片法檢查可知研究組陽性率為（88.35%）、對照組陰性率為（98.06%）。見附表1。

2.2 漂浮集菌涂片法及FQ-PCR法診斷效能 FQ-PCR法對肺結核診斷敏感度（98.06%）、準確度（97.57%）高于漂浮集菌涂片法（88.35%、93.20%）（P＜0.05），FQ-PCR法對肺結核診斷特異度（97.09%）與漂浮集菌涂片法（98.06%）間無顯著差異（P＞0.05）。見附表2。

附表1 漂浮集菌涂片法及FQ-PCR法檢查結果[n(%)]

附表2 漂浮集菌涂片法及FQ-PCR法診斷效能(n=206)

3 討論

抗結核治療存在不規范性，導致患者機體中結核桿菌對抗結核藥物出現耐藥，并形成耐多藥結核病或耐藥結核病。因此，如何早期診斷肺結核并進行針對性治療仍是研究熱點。肺結核常規診斷中，肺泡灌洗液、痰液、漿膜腔積液檢測為最可靠診斷措施，結核分枝桿菌細胞壁中存在較多脂類，其不易著色，但延長染色時間并加溫處理后，則較難被酸性脫色劑脫色，故臨床依據此原理常采取痰涂片法對疑似肺結核患者實施診斷鑒別。痰涂片檢查雖具有操作簡單等優勢，但檢查結果極易受操作者主觀因素及含菌量低等因素影響；痰培養法則由于結核桿菌特殊細胞壁結構導致生長速度較慢，常規L-J培養用時較長，而快速培養系統（包括BACT/ALERT 3D及Bactec MGIT 960等快速培養系統）雖然可以顯著提升檢測速度及檢出率，但其對痰涂片陽性標本培養用時仍可達7～10d，無法實現肺結核患者早期快速診斷及治療[3][4]。X線胸片在肺結核診斷中也較常用，但其極易對非典型病例造成漏診及誤診，診斷效能較低，多需聯合實驗室檢查進行綜合診斷。

FQ-PCR法為近十幾年得到發展應用的核酸擴增新技術，具備可定量、結果客觀、自動化、重復性好、特異度及敏感度高、檢測迅速等優勢，且相較于常規PCR檢查，其具備一定抗污染性，較適用于無法或較難進行人工培養的病原體測定。相關研究表明，FQ-PCR把熒光反應物置入普通PCR反應體系，以此使其和PCR擴增產物間發生關聯性，通過測定PCR擴增反應內熒光強度改變定量分析標本內DNA特定序列，相較于普通PCR反應，FQ-PCR法整個反應均于單一管中進行，可最大程度地避免樣本遭受污染，保證診斷的有效性[5]。本研究結果顯示，FQ-PCR法對肺結核診斷敏感度、準確度高于漂浮集菌涂片法（P＜0.05），表明采取FQ-PCR法對肺結核實施診斷，可顯著提升診斷敏感度及準確度，最大程度降低漏診風險，避免延誤患者最佳干預時機。

綜上所述，FQ-PCR法在肺結核診斷中具有較高應用價值，可有效檢出結核桿菌，提高肺結核診斷準確度及敏感度，避免漏診，為臨床及早制定、調整有針對性干預方案提供客觀參考依據。