多管發酵法在居民日常生活飲用水微生物檢測中的應用

河南省滎陽市疾病預防控制中心（450100）楊麗娟

水是人體必不可缺的生命之源，有助于保持體溫，改善機體組織細胞液，促進新陳代謝，然而隨著我國經濟持續發展，生活工業用水大量增加，日常飲用水污染也在不斷加重，嚴重影響居民生活質量[1][2]。過濾、消毒等是既往處理日常生活飲用水中微生物的常用方法，雖能減少水中微生物含量，但由于生活環境較為復雜，日常生活飲用水污染現象仍未得到明顯抑制[3]。同時，有學者指出，菌落總數與游離余氯超標是居民日常生活飲用水水質不合格的原因[4]。因此，為保障日常生活飲用水安全，維護居民健康，及時實施科學有效的日常生活飲用水檢驗方案是重要前提。基于此，本研究隨機抽取597份居民日常生活飲用水水樣，探討多管發酵法在微生物檢測中的應用價值，旨在為科學選取水質檢測方法提供循證指導。具體分析如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2019年10月～2020年4月居民日常生活飲用水水樣597份，所有樣本均嚴格遵循生活飲用水標準檢驗方法水樣采集與保存流程進行。根據不同檢驗方式分為對照組（298份）、實驗組（299份），其中對照組水樣來源：32份出廠水、130份管網末梢水、136份二次供水；實驗組水樣來源34份出廠水、128份管網末梢水、137份二次供水。兩組水樣來源資料均衡可比（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 對照組 采用濾膜法檢驗。準備微孔濾膜（0.45μm，購自上海摩速科學器材有限公司）、試管、顯微鏡、無齒鑷子、不銹鋼手提式滅菌器（購自北京金洋萬達科技有限公司）、恒溫培養箱（購自上海飛越實驗儀器有限公司）等相關儀器及設備。于燒杯內置入微孔濾膜，注入蒸餾水，酒精燈煮沸滅菌。滅菌后以無菌鑷子夾起微孔濾膜，置于無菌濾床上方，避免微孔濾膜粗糙面向下。注入日常生活飲用水水樣（100ml），開啟閥門，實施抽濾操作，抽濾條件為-0.05Pa。過濾完成后實施抽氣，時間控制在5s內，抽氣過程中需關閉閘門，取出過濾器。再次以無菌鑷子夾起微孔濾膜，放入紅亞硫酸鈉培養基內，保證殘留細菌面朝上，最后置入37℃恒溫箱內進行培養，培養時間為22～26h。若出現產氣情況，則表示總大腸菌群呈陽性，計算每升水樣中總大腸菌群數的最近似值。

1.2.2 實驗組 采用多管發酵法檢驗。準備微孔濾膜、試管、顯微鏡、無齒鑷子等相關儀器及設備。首先培養總大腸菌群。后于裝有單料乳糖蛋白胨培養液（10ml）試管內注入日常生活飲用水水樣（1.0ml），而單料乳糖蛋白胨培養液配制方法為將蛋白胨（25g）、氯化鈉（15g）、乳糖（15g）分別加入蒸餾水（1000ml）中，并使用牛肉膏（10g）進行加熱溶解，將pH值調整至7.1～7.5范圍內，后加入溴甲酚紫乙醇溶液（2ml，濃度為1.5%）充分混勻，分別裝入試管內，再放于高壓蒸汽滅菌器（110℃～120℃）內充分滅菌15～20min，置入冰箱內貯存待檢。同時于裝有雙料乳糖蛋白胨培養液（10ml）的試管中注入日常生活飲用水水樣（10ml），并在裝有生理鹽水（9ml）的試管中注入日常生活飲用水水樣（1ml），充分混勻后，將單料乳糖蛋白胨培養液注入混合液（1ml）內。污染嚴重的日常生活飲用水水樣可適度增大稀釋力度。接種完成后，將樣本放入37℃恒溫箱內進行培養，時間約為24h。24h后取出，若試管內未出現產酸產氣情況，則表示大腸菌群呈陰性；若試管內出現產酸產氣情況，則嘗試將試管放于伊紅美藍瓊脂板培養基上方轉種，伊紅美藍瓊脂板培養基制備方法為將瓊脂（25g）注入蒸餾水（500ml）中，加熱，充分溶解，后均勻混合磷酸氫二鉀（1.5g）、蛋白胨（8g）至充分溶解，分裝至燒瓶內，接受滅菌、冷卻、凝固等處理。轉種后再次放進恒溫箱內培養，密切監測菌落形態。

附表 兩組微生物檢出情況比較[n(%)]

1.3 觀察指標 ①比較兩組飲用水水樣檢驗合格率，其中日常生活飲水中細菌總數＜100個/ml為合格。②比較兩組微生物檢出情況。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0統計學軟件處理數據，計數資料用n（%）表示、χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組飲用水水樣檢驗合格率 實驗組飲用水水樣檢驗總合格率96.32%高于對照組的77.52%（P＜0.05）。

2.2 微生物檢出情況 兩組雜菌、大腸菌群檢出率比較無顯著差異（P＞0.05）；實驗組大腸埃希菌、耐熱大腸菌群檢出率高于對照組（P＜0.05），見附表。

3 討論

據世界衛生組織調查顯示，受水污染問題影響，全球約有12億人出現腸道傳染性疾病，其中死于水污染疾病兒童人數高達400萬[5]。故重點把控居民日常生活飲用水質量具有重要意義。

大腸菌群是導致腸道疾病發生的病菌總稱，也是監測食用水源及餐具等生活用品是否遭受糞便污染的主要標準，我國食品衛生將其納入主要檢測范圍內[6]。微生物檢驗是評估日常生活飲用水質量的重要手段，一定程度可確保水質在流行病學方面的安全性及可靠性。近年來，濾膜法憑借監測結果重現性好、精密性高，在飲用水水質微生物檢測中得到廣泛運用，尤其是清潔度較高的水樣，但截留在濾膜上大腸桿菌含量超標，會導致培養后過濾膜上大腸桿菌菌落過于密集，無法精準計數菌落，影響測定結果。同時，濾膜法檢驗結果準確性和可靠性與檢驗人員經驗、技術水平也存在一定關系，且確認結果約需48h，不適用于預防應對突發公共衛生事件。多管發酵法是目前監測糞大腸桿菌群標準方法，具有技術成本低、結果精準性高等優點，可通過糞大腸菌群發酵乳糖、產酸產氣需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，準確計數糞大腸桿菌群[7]。本研究結果顯示，實驗組飲用水水樣檢驗總合格率96.32%高于對照組77.52%（P＜0.05）。可見多管發酵法可有效提高飲用水水樣檢驗合格率。此外，劉笑笑等[8]研究顯示，按照JJF 1059.1.2012《測定不確定度評定與表示》和SN/T4091-2015《食品微生物學測量不確定度評估指南》，多管發酵法適用于類似條件下總大腸菌群測定不確定度的評估。本研究數據表明，實驗組大腸埃希菌、耐熱大腸菌群檢出率高于對照組（P＜0.05）。提示多管發酵法在檢出居民日常生活飲用水中大腸埃希菌、耐熱大腸菌群等微生物中具有一定積極效應。因此，為減少飲用水污染程度，相關管理部門應從源頭做起，及早檢測飲用水水質，明確總大腸菌群含量，加強對日常生活飲用水所在區域消毒、滅菌等管理工作，同時，也要加大宣傳力度，廣泛普及飲用水安全知識，從根本上預防和減少居民日常生活飲用水源污染問題。

綜上可知，多管發酵法可有效提高居民日常飲用水水樣檢驗總合格率，檢出大腸埃希菌、耐熱大腸菌群等微生物。