妊娠中期胎兒7 446例羊水染色體核型結果分析*

范美榮，隨瑞枝，宋旭梅

(寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心，寧夏 銀川 750000)

染色體病是由染色體數目異常或結構異常導致的疾病，是導致新生兒出生缺陷中最常見的遺傳性疾病，我國染色體病患兒占新生兒的0.5%～0.1%，主要特征為生長發育遲緩、智力低下和多器官畸形等。目前尚無有效治療方法，給社會和家庭造成了沉重的經濟及精神負擔，僅可通過產前診斷預防此類患兒的出生。羊膜腔穿刺及羊水染色體核型分析是最常用且安全、可靠的侵入性產前診斷技術，是胎兒染色體疾病診斷的“金標準”。本研究對7 446例妊娠中期胎兒羊水染色體核型結果及產前診斷高風險指征進行了回顧性分析，以期為臨床遺傳咨詢工作提供科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2010年1月至2019年12月本院產前診斷中心收治的進行遺傳咨詢并進行羊水穿刺孕婦7 446例，年齡18～47歲，孕周15～27周。診斷指征包括血清學篩查高/臨界風險、年齡高風險(生育年齡大于或等于35歲)、超聲檢測異常、夫婦一方染色體異常、無創基因檢測高風險、不良孕產史等。術前與孕婦及家屬簽署知情同意書，并充分告知羊膜腔穿刺的注意事項和臨床意義。

1.2方法 按傳統制備方法，醫生在超聲引導下經腹部行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL，分裝在2個無菌離心管中，離心去上清液后分別接種至2個含有羊水培養基的培養瓶內，然后置于37 ℃二氧化碳培養箱中培養至7～10 d，當貼壁羊水細胞生長旺盛時于低倍鏡下觀察有3～5個大集落或6～8個中小集落時進行換液。再繼續培養1～2 d，待貼壁細胞幾乎平鋪整個培養瓶時加20 μg/mL秋水仙素50 μL，將羊水細胞阻留至中期分裂相。繼續培養4 h后收獲羊水細胞，經消化、低滲、預固定、固定、制片、顯帶等步驟后進行染色體核型分析。每例羊水標本兩線培養物共計數20個分裂相，至少分析5個核型，異常核型加大計數和核型分析，核型按《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2016)》命名。對部分多態性變異加做N顯帶及C顯帶檢測，以明確其性質。本研究未將染色體多態納入異常染色體范疇。7 446例羊水培養中有2例為嚴重血性標本，均只有一線成功培養并制備出染色體，最終用一線羊水培養結果發放報告并告知臨床及孕婦。

2 結 果

2.1羊水染色體核型分析結果 7 446例孕婦中檢出異常核型665例，異常檢出率為8.9%。

2.2異常染色體核型分布情況 665例異常染色體核型中檢出非整倍體異常核型419例(63.0%)，其中21-三體(包括羅氏易位型21-三體)231例(34.7%)，18-三體52例(7.8%)，13-三體4例(0.6%)，性染色體86例(13.0%)，額外微小標記染色體6例(0.9%)，非整倍體異常核型與正常核型組成的嵌合體40例(6.0%)，性染色非整倍體異常中包括47，XXY(Klinefelter 綜合征)35例，47，XXX(XXX綜合征)23例，47，XYY(XYY綜合征)9例，45，X(Turner 綜合征)19例。665例異常染色體核型中檢出染色體結構異常246例(37.0%)，其中平衡性結構異常包括平衡易位62例(9.3%)，羅伯遜易位21例(3.2%)，倒位28例(4.2%)，插入3例(0.4%)；非平衡性結構異常包括衍生染色體39例(5.9%)，增加7例(1.0%)，缺失10例(1.5%)，環形染色體7例(1.1%)，假雙著絲粒染色體21例(3.2%)，等臂染色體16例(2.4%)，結構異常染色體與正常核型組成的嵌合體32例(4.8%)。見表1。

表1 異常染色體核型分布情況(n=665)

2.3不同產前診斷指征的異常核型發生率比較 7 446例孕婦產前診斷指征構成比由高至低依次為血清學篩查高/臨界風險、年齡高風險(生育年齡大于或等于35歲)、超聲檢測異常、夫婦一方染色體異常、無創產前基因檢測(NIPT)高風險、不良孕產史、年齡高風險合并其他指征、其他指征(包括孕早期不良接觸史、用藥史、羊水過多/過少、患者要求等)。665例異常染色體核型中異常檢出率由高至低的產前診斷指征依次為NIPT高風險、夫婦一方染色體異常、年齡高風險(生育年齡大于或等于35歲)、超聲檢測異常、年齡高風險合并其他指征、血清學篩查高/臨界風險、不良孕產史、其他指征。見表2。

表2 不同產前診斷指征的異常核型發生率比較

3 討 論

我國是出生缺陷的高發國家，根據《中國出生缺陷防治報告(2012)》的統計，我國出生缺陷發生率與世界中等收入國家的平均水平接近(5.6%)，每年新增加出生缺陷數為90萬例，其中出生時明顯可見的出生缺陷有25萬例。出生缺陷不但是造成兒童殘疾的重要原因，也日漸成為兒童死亡的主要原因，在全國嬰兒死因中的比例高達19.1%[1]。通過羊膜腔穿刺抽取孕中期羊水標本進行羊水細胞培養及染色體核型分析是最常見且安全、可靠的侵入性產前診斷技術，也是降低圍產兒死亡、預防異常胎兒的出生、降低出生缺陷的重要手段。本研究結果顯示，7 446例孕婦中檢出異常核型665例，異常核型檢出率為8.9%，高于國內外其他文獻報道的2.8%[2]和6.7%[3]。可能與本院臨床醫師及患者對產前診斷指征把握較為嚴格有關，同時，由于部分高風險孕婦對羊水穿刺有創性檢查的擔憂，往往會優先選擇NIPT，只有NIPT 結果陽性才會繼續進行產前診斷，也在一定程度上造成了異常檢出率較高。

由表1可見，665例異常染色體核型中非整倍體異常核型419例(63.0%)，與相關文獻報道結果基本一致[4]。其中21-三體最多，其次為性染色體非整倍體異常和18-三體，而非整倍體異常核型與正常核型組成的嵌合體、額外微小標記染色體和13-三體較少。大量研究表明，非整倍體產生的原因主要是生殖細胞在第1次或第2次減數分裂或受精卵卵裂時發生的不分離所致，而女性隨著年齡的增長，卵巢功能退化及卵子質量下降會使減數分裂時紡錘體發生障礙的概率增加，從而造成染色體的不分離[5]。21-三體和18-三體綜合征是最重常見的染色體非整倍體異常疾病，在新生兒中21-三體綜合征發病率為1/800～1/600，18-三體綜合征發病率為1/8 000～1/4 000，患兒均有嚴重的智力障礙，并伴多器官及組織畸形[6]。本研究中高風險孕婦21-三體發病率和18-三體發病率均顯著高于新生兒，也證明了具有高風險指征的孕婦進行羊水染色體檢查的必要性。其中21-三體中包括羅氏易位型21-三體25例，其發病機制可能為雙親之一為羅伯遜易位攜帶者或是染色體長臂復制形成了等臂染色體[7]。目前，常染色體非整倍體異常均無有效治療辦法，因其多表現出嚴重出生缺陷，在產前診斷后需立刻終止妊娠，以避免缺陷患兒的出生。本研究檢出性染色非整倍體異常86例(13.0%)，這些性染色體非整倍體異常患兒臨床表現主要為性腺發育不良、身高異常及生育障礙等，少數會出現語言行為異常及智力障礙[8]。性染色體非整倍體異常同樣無法根治，但有改善癥狀的治療方法，因此，通常臨床醫師在告知孕婦相關風險后應由其自行決定患兒去留。另外本研究中6例增加額外微小標記染色體的胎兒經檢查夫妻雙方染色體后2例胎兒遺傳自母親選擇繼續妊娠，4例胎兒為新發突變，新發突變病例進一步經微陣列比較基因組雜交技術檢測后，其中2例標記染色體攜帶致病性的拷貝數變異而選擇終止妊娠，2例標記染色體組成為隨體及異染色質，無致病性而選擇繼續妊娠。

據文獻報道，80.0%的染色體結構異常為家族遺傳，少部分為新發突變[9]。本研究結果顯示，665例異常染色體核型中檢出染色體結構異常246例(37.0%)，其中平衡性結構異常因不涉及遺傳物質的增減，一般無臨床表現。但其中的染色體平衡易位及羅伯遜易位攜帶者在生育下一代時的生殖細胞減數分裂過程中平衡變異染色體可隨機形成18個不同的配子，僅有2個配子能發育為正常胚胎或相互易位型胚胎，從而會直接影響妊娠結果，出現復發性流產、生化妊娠、死胎、生育染色體病患兒等[10-11]。染色體倒位攜帶者生殖細胞在減數分裂過程中與正常同源染色體配對交換，理論上講能形成正常、倒位、部分重復或部分缺失4種不同配子，同樣會對生殖異常具有一定的遺傳學效應，其效應主要取決于倒位片段長度及其所含基因的致死效應[12]。因此，此類平衡性結構異常胎兒需結合超聲、血清學篩查等其他檢測結果綜合判定，并告知夫妻雙方進行染色體檢查，明確染色體變異來源是遺傳自父母還是新發，如為新發還需進一步運用分子遺傳學技術檢測，以明確胎兒是否伴染色體微缺失或微重復。臨床醫師在進行遺傳咨詢時需告知夫婦雙方此胎兒在以后再次生育下一代時可能產生的影響，由夫婦雙方自主選擇繼續妊娠或終止妊娠。而非平衡性染色體異常因有遺傳物質的增加或缺失，通常會伴有超聲檢測結果異常，此類胎兒出生后會有明顯的實質性器官發育異常及精神發育障礙，因此，孕婦需選擇終止妊娠。

由表2可見，在產前診斷高風險指征中血清學篩查高/臨界風險比例最高，其次為年齡高風險(生育年齡大于或等于35歲)，與相關文獻報道結果一致[13]。血清學篩查因其無創、安全、價格低廉等特點，是35歲以下產婦較為普遍的篩查方法，但血清學篩查的檢出率相對較低，具有較高的假陽性和假陰性[14]。為避免漏診陽性病例，本院臨床醫師在進行遺傳咨詢時將血清學篩查臨界風險(21-三體1/1 000～1/270、18-三體1/1 000～1/350)也納入羊水穿刺產前診斷的高危指征。血清學篩查臨界風險孕婦生育異常患兒的概率相較于其他指征低，故本研究中血清學篩查高/臨界風險指征比例高達32.5%，而異常核型僅檢出20例，異常核型檢出率為0.8%，明顯低于相關文獻報道[15]。20例異常核型中21-三體10例，18-三體2例，性染色體數目異常2例，其他異常核型6例，也表明產前血清學篩查高/臨界風險不僅可檢出21-三體、18-三體和神經管畸形患兒，對性染色體數目異常及染色體結構異常也具有一定的預警作用。

臨床將預產年齡大于或等于35歲的孕婦稱為高齡孕婦，近年來，隨著“二孩”政策的全面開放，高齡孕婦比例逐年升高。NEAGOS等[15]研究表明，在40～45歲孕婦中生育21-三體的比例高于25～30歲孕婦。CRANDALL等[16]研究表明，20歲女性生育21-三體的概率為1/2 000，但當母親45歲時其概率則增加至1/40。因此，對高齡孕婦進行羊膜腔穿刺和胎兒染色體核型分析非常有必要。由表2也可見，單純高齡孕婦異常檢出率(6.6%)明顯低于高齡合并其他指征的異常檢出率(24.7%)，表明高齡孕婦如合并其他產前診斷檢測指征會大大增加發生胎兒染色體異常的風險。由表2還可見，產前診斷高風險指征中異常核型檢出率最高的指征為NIPT高風險(48.0%)，與BENN等[17]研究結果一致，說明NIPT對胎兒染色體核型異常特別是對21-三體的檢出方面具有較高的準確性。NIPT技術因具有無創性、可重復性、檢查時間早、靈敏度高、有商業保險賠付等優勢，近年來，廣泛用于胎兒21、18、13-三體及性染色體非整倍體異常的篩查。本研究中 NIPT高風險相關的產前診斷指征共檢出異常核型179例，其中21-三體85例，18-三體16例，性染色體數目異常40例，其他染色體異常38例，與國內外相關文獻報道結果基本一致[18]。表明NIPT 技術不同于目前的血清學篩查，對常見非整倍體染色體異常具有較高的靈敏度和特異度，同時，對其他染色體異常也可做出預警。但值得注意的是NIPT技術只能作為高精度的篩查技術，還不能作為臨床診斷技術，對NIPT篩查高風險孕婦必須再次進行羊水穿刺進行產前診斷。

當夫婦一方染色體異常作為產前診斷高風險指征時通常為夫婦之一為平衡易位或倒位等平衡性結構異常攜帶者，此時生殖細胞在減數分裂過程中可隨機形成正常或異常配子，胎兒有極大的可能形成非平衡性結構異常。本研究中夫婦一方染色體異常相關高風險指征共檢出4例21-三體，1例18-三體，4例性染色體數目異常和149例其他染色體異常。也提示存在染色體異常夫婦在生育下一代時進行羊膜腔穿刺是非常有必要的。目前，羊水染色體分析結合超聲診斷已成為產前診斷中最常用的方法，超聲檢測異常包括胎兒心臟異常、胎兒頸項透明層增厚，肢體發育不良、脈絡叢囊腫等一項或多項軟指標異常。本研究中孕中期超聲檢測異常81例，異常核型檢出率為6.7%，低于相關文獻報道[19]；這是因為本院針對部分一過性超聲檢測異常孕婦先建議其選擇NIPT檢測，NIPT高風險者再進一步做羊膜腔穿刺進行產前診斷。

本研究中出現40例非整倍體異常核型與正常核型組成的嵌合體，以及32例染色體結構異常核型與正常核型組成的嵌合體。羊水染色體的嵌合體存在真假性嵌合，胎兒本身的嵌合為真性嵌合，真性嵌合發生的概率往往比較低，會對胎兒智力、生長發育造成影響。而假性嵌合是由羊膜腔穿刺過程中的母體細胞污染、胎兒細胞有絲分裂異常及羊水細胞突變等因素所致，需進一步給予臍帶血染色體核型檢查以驗證真假性嵌合。本研究經與臍帶血染色體核型檢查結果比較，40例非整倍體異常核型與正常核型組成的嵌合體中有8例真性嵌合和11例假性嵌合，32例染色體結構異常核型與正常核型組成的嵌合體中有5例真性嵌合和10例假性嵌合。其他患兒因嵌合比例較低及其他個人原因未給予臍帶血染色體核型分析驗證，本研究也未追蹤到其妊娠結局。胎兒真性嵌合的臨床表型取決于嵌合體中異常核型比例、異常核型類型和所涉及基因組大小和功能等，另外也需參考超聲檢測及家族史等各項內容，進行充分的遺傳咨詢并告知患者可能的風險，由其家屬自行決定繼續妊娠或終止妊娠。

綜上所述，對產前診斷高風險指征孕婦進行羊水細胞培養及染色體核型分析可及時檢測出染色體異常胎兒，有效降低新生兒出生缺陷發生率，從而達到優生優育的目的，具有較高的臨床應用價值和指導意義。