腦血管源性細胞間通訊異常與腦疾病機制研究

陸 露，劉秀秀，李政懋，韓 峰

(南京醫科大學藥學院，心腦血管醫學重點實驗室，江蘇 南京 211166)

中樞神經系統疾病的發生往往被認為是由于大腦神經網絡的穩態遭到破壞，進而引起神經元細胞的異常代謝和凋亡。神經元作為神經傳遞的基本信號單元，一直以來是神經科學研究的熱點。幾十年來諸多研究集中于神經元這個單一類型，開展分子機制的解析和藥物靶標的研究。但是，基于單獨神經元保護理論的藥物靶標發現和新藥研發在臨床試驗中屢屢受挫。由此，本領域研究者逐漸認識到，游離于系統生物學理論之外的單一類型細胞“純凈”研究系統，難以解釋腦疾病復雜病理過程和機制[1]。迄今為止，尚不清楚多種神經元細胞和各種分子如何協同作用以實現復雜的腦功能以及病理過程。研究者們發現，大腦是通過特定的機制獲得持續不斷的氧氣和營養物質的，1890年Roy等人首次提出了神經結構如何影響大腦血流調節的機制。這也提示著研究者們，僅以神經元為中心的聚焦是不夠的，必須結合所有大腦中的細胞類型，包括神經元、神經膠質和血管成分。這些不同來源的細胞間信號傳導和耦聯構成了正常生理過程的基礎，而信號和耦聯紊亂則是神經功能障礙和引發病變的關鍵生物化學基礎。腦內基本功能單元被稱為“神經血管單元(neurovascular unit，NVU)”，是由神經元及其相關的神經膠質細胞和內皮細胞等組成，在相同的微環境中具有正負反饋機制的相互作用。

圍繞神經血管單元的概念，神經病理學的研究達到了新的高度。腦內的信號轉導需要神經元和神經膠質細胞、血管細胞等之間的相互作用，從而介導神經遞質的釋放和突觸再攝取。血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的完整性也是維持正常腦功能必不可缺的條件，主要取決于神經膠質細胞和腦微血管內皮細胞、周細胞等的相互作用。已有一些報道證明神經血管單元的組成部分損傷存在于急性腦病中，例如創傷性腦損傷和腦卒中等；同時也存在于慢性疾病中，例如癡呆等退行性疾病。在這些病理過程中，存在著較為常見的特征，例如血腦屏障的通透性和選擇性的缺失、細胞基底層成分的降解以及炎癥反應等。此外，周細胞假說近年來逐漸成為腦疾病相關的研究熱點[2]。因此，靶向神經血管單元可能成為神經血管疾病治療的新策略。

神經血管單元研究的最終目的是發現和確證治療腦病的藥物靶標。臨床研究表明，基于單獨神經元保護的治療策略未能達到確切的療效[3]。以腦卒中為例，該病是高發的、具有高致死率和致殘率的中樞神經系統疾病。盡管通過溶栓治療和血栓切除手術改善缺血性腦卒中患者的預后，但這兩種方法治療效果有限。由于在腦卒中等疾病的病理過程中，神經元的存活與死亡是重要的終點現象，而疾病發生發展及轉歸過程中神經血管單元各組分細胞全部參與其中，由此靶向神經血管單元的治療方法預計可以產生更顯著的治療效果。深入了解以神經元為中心的神經血管單元的結構與功能，將更能真實地模擬臨床腦疾病病理過程，有助于解析疾病發生發展及轉歸過程中腦微血管網絡的細胞間信號通訊時空變化規律，在此基礎上發現和確證治療各類腦病的藥物靶標。

1 神經血管單元構成細胞間通訊的結構和功能平臺

1.1 神經血管單元腦血流是氧氣和營養物質輸送到大腦特定腦區的保證，神經血管單元根據神經系統需求來改變血液的供應。神經血管單元的提出，更加強調了多種細胞類型之間共同協作發揮作用，以維持大腦結構與功能的完整性。神經血管單元由神經元、神經間質、星形膠質細胞、周細胞、血管內皮細胞和細胞外基質構成(Fig 1)。神經血管單元的各個組成部分形成相互緊密連接，形成了一個完整的結構體系，從而構成高效的腦血流調節系統。激活的神經元釋放物質并擴散到血管，改變血管平滑肌狀態以調節腦血流量。縫隙連接和粘附分子(鈣黏蛋白和整合蛋白等)參與各組成部分間的相互作用，可以促進Ca2+、K+和ATP等的運輸[4]。神經血管單元的精密結構是一系列遺傳編碼事件的結果。

Fig 1 The schematic diagram of neurovascular unit structure

1.2 神經血管耦聯正常的大腦功能取決于神經血管單元間神經元和血管脈管系統功能之間的密切耦聯。神經元通過產生信號分子(如谷氨酸和Ca2+等)來調節腦血流量，該信號直接或通過關聯的細胞作用于局部血管以引發血管反應。鄰近的星形膠質細胞起信號傳遞作用，其與突觸和局部微血管密切相關，很好地將神經活動與腦微血管功能聯系起來。內皮細胞在神經血管信號的逆向傳播中具有重要作用，調節腦血流量以響應相應化學和機械信號。平滑肌細胞和周細胞被認為是血管舒縮反應和血流調節的主要效應器，神經元及其他細胞產生的活動信號最終與平滑肌細胞與周細胞結合以改變血流量。以腦缺血損傷病理過程為例，這一系列的耦聯作用參與調控神經-微血管網絡的動態變化[6]。見Fig 2。

Fig 2 The schematic model of neurovascular coupling in normal condition and ischemic injury

神經血管單元的細胞組分間信號傳導規律是理解功能耦聯以及可能有助于腦部疾病發展的無序耦聯的關鍵，然而神經血管耦聯的潛在分子和細胞機制仍然知之甚少[5]。

2 腦血管源性細胞間通訊異常參與介導腦疾病模式及機制

2.1 腦血管源性分泌蛋白調控細胞間通訊模式脈管網絡中的非神經元細胞對中樞神經系統的信號接收和調控是維持大腦功能不可或缺的，營養成分、水和氧氣的交換需求通過提示傳遞入腦微脈管網絡，以滿足高度活躍的神經環境的生理和代謝需求。神經元釋放神經調節蛋白和腦源性神經營養分子并由血腦屏障轉運，通過微環境的離子穩態和信號傳導介質，神經血管單元的組成部分實現多維、連續的通訊來維持中樞神經系統的穩態。腦微血管內皮細胞通過連接粘附分子和附著蛋白形成緊密連接，構成BBB。BBB的完整性和通透性與腦血管病直接相關，BBB分解導致神經元丟失及突觸功能障礙，引起認知功能退化和神經炎癥。理清病理生理過程中局部腦微環境的物質基礎變化將有助于探尋細胞間的通訊規律。因此，血管內皮細胞是否可以直接與神經元通訊，從而參與中樞神經系統生理病理過程是值得探究的問題，新興的血管內皮細胞分泌的蛋白在組織中的作用仍有待探尋。

腦內分泌蛋白在特定細胞內合成后，分泌到細胞外起信號轉導作用，進而調節大腦正常功能。有研究從血管內皮細胞分泌蛋白Semaphorin 3G(Sema3G)著手，探索了腦內血管內皮細胞與神經元之間進行跨細胞類型的配體受體信息交流的新模式。Sema3G是最近發現的一類分泌信號蛋白亞家族的成員，主要表達在內皮細胞中，在神經元或膠質細胞中均無表達。研究發現血管內皮細胞特異性敲除Sema3G的小鼠存在認知功能障礙表型，由此研究者推測這種模型中血管內皮細胞和神經元細胞群間可能會存在通訊異常[2]。表達譜結果表明內皮特異性分泌的Sema3G介導腦微血管內皮細胞與神經元通訊。血管內皮細胞條件敲除Sema3G誘發的小鼠認知功能障礙與海馬CA3到CA1區的興奮性突觸環路連接的削弱關聯，減少了海馬CA1錐體神經元的興奮性突觸數量。Sema家族分泌蛋白激活叢狀蛋白(plexin)受體需要神經纖毛蛋白2(neuropilin-2，Nrp2)來穩固相互連接作用[2]。進一步對突觸功能的研究顯示，內皮中Sema3G通過突觸后Nrp2/PlexinA4信號介導Sema3G對興奮性突觸傳遞的影響。此項研究明確了內皮細胞傳遞到大腦神經元信號的精確分子事件，發現了全新的神經-血管相互作用機制，為血管內皮細胞調節海馬認知功能相關的神經元及突觸可塑性提供了重要依據。但是受到技術等因素的限制，該研究沒有對血管內皮細胞中Sema3G蛋白的分泌調控機制和分泌后胞外運輸途徑進一步探索。

在腦部多種與炎癥相關的疾病中，如中風、血管性癡呆和多發性硬化癥中，均觀察到了神經血管協調性的破壞。Duan等[6]在急性感染的小鼠中發現，全身炎癥的2 h內，PDGFRβ血管壁細胞迅速分泌CC趨化因子配體2(CC chemokine ligand 2，CCL2)，通過促進多個腦區的谷氨酸能神經元的興奮性突觸傳遞而增加神經元興奮性。實驗結果證明了在體內PDGFRβ細胞通過分泌CCL2充當外周損傷的起始傳感器，對環境變化做出快速反應，協調血管與神經元在急性炎癥中的耦聯作用。腦部感染或損傷引起的炎癥在不同程度上激活內皮和神經膠質細胞，促進分泌細胞因子以響應腦損傷反應。從神經血管單元的整體關聯出發，明確與血管源性分泌因子作用的相關神經膠質細胞類型(例如星形膠質細胞和小膠質細胞)，以及它們在腦疾病的發生、發展和轉歸階段的潛在功能變化和機制，可以很好地從分子水平解釋神經病理學和血管功能障礙的合并癥。

2.2 星形膠質細胞承前啟后調控不同類型細胞間通訊模式星形膠質細胞在神經元與毛細血管和周細胞間建立多功能連接，參與細胞間的長距離通信。星形膠質細胞與神經元信號相互作用是特異的，呈現出高度的復雜性。星形膠質細胞的靜息鉀電導較大，極負性的膜電位有助于谷氨酸的攝取，同時也釋放前列腺素、ATP等物質，促進血管的舒張和收縮。星形膠質細胞間隙連接的耦聯調節和其形態變化的依賴機制均能影響癲癇發作[7]。BBB的微血管系統的穩態破壞被認為是導致癲癇在內的腦部疾病的病因之一。劉等[8]報道了一種血管源性的新型自發性癲癇研究模型，對血管源性病因引發癲癇活動發作的分子機制進行了探索。內皮細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase 5，Cdk5)缺失以年齡依賴性方式誘發自發性海馬癲癇放電，四周齡的敲除小鼠海馬CA1錐體神經元興奮性和海馬細胞外的谷氨酸明顯增加。由于星形膠質細胞對維持谷氨酸穩態有重要作用，研究者進一步檢測了神經膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的水平。免疫染色實驗發現突變小鼠中GFAP陽性星形膠質細胞數量增加，提示著內皮細胞敲除Cdk5引起進行性星形膠質細胞增生并損害星形膠質谷氨酸轉運體1(glutamate transporters，Glt1)功能。此外，實驗結果顯示Cdk5缺乏誘導內皮中衍生的趨化因子配體1 (C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1)異常升高，通過星形膠質細胞中趨化因子受體2(C-X-C motif chemokine receptor 2，CXCR2)調節其谷氨酸的攝取。因此，以上研究揭示了血管內皮源性Cdk5通過CXCL1/CXCR2級聯反應觸發神經膠質細胞和神經元的功能異常，為治療癲癇提供了神經血管單元潛在新靶標[8]。

鑒于星形膠質細胞在生理性腦功能中有許多潛在的作用，其功能障礙可能導致多種腦部疾病的發展。研究報道血管周圍神經膠質瘤細胞能夠破壞BBB和星形膠質細胞和血管的偶聯，但不損傷血管平滑肌細胞。膠質瘤細胞可通過高度表達的Ca2+激活的K+通道來調節周圍血管的直徑從而影響腫瘤浸潤區域的血流量[9]。星形膠質細胞也是參與突觸功能的不可或缺的元素，兩者與神經元建立雙向通訊，釋放影響神經元和突觸活動的神經膠質遞質。早期的皮層-紋狀體環路中星形膠質細胞增生驅動了亨廷頓舞蹈癥(Huntington′s disease，HD)的病理過程，并伴隨鉀離子通道4.1(Kir4.1)、Glt1和Ca2+信號轉導變化[10]。研究表明這種Ca2+和Glt1信號的功能紊亂可以被特異的星形膠質細胞中Kir4.1修復所挽救，強調了K+穩態機制在HD中的重要作用，提示著星形膠質細胞和其前驅信號分子有望逆轉紋狀體環路缺陷，成為HD的新型治療靶點[10]。在唐氏綜合征模型中較早地發現了相較于生理情況下星形膠質細胞更為頻繁的自發性鈣波動信號，從而影響神經元興奮性和突觸連接異常[11]。后續研究發現，利用γ-氨基丁酸受體拮抗劑、5-羥色胺重攝取抑制劑和天冬氨酸受體拮抗劑等小分子藥物阻斷星形膠質細胞和神經元間的通訊[12]，可調節神經元興奮性和突觸連接功能的病理變化，進一步證明星形膠質細胞中Ca2+信號和神經元之間的特定相互作用。綜上所述，星形膠質細胞通過諸多神經遞質與離子通道介導血管與神經元的串聯調控作用，參與中樞神經系統生理發育和病理損傷的過程。未來，更多的與星形膠質細胞功能相關的突觸受體和離子通道的調控化合物有望成為神經系統疾病的新型治療藥物。

2.3 小膠質細胞雙向調控細胞間通訊模式小膠質細胞是大腦內的巨噬細胞，被認為是不同腦部損傷引發神經炎癥反應的前哨[13]，因而小膠質細胞在中樞神經系統疾病中的調節效應得到廣泛的關注。小膠質細胞是神經血管單元內的重要組成部分之一，與其他類型細胞產生協調作用。已有研究表明小膠質細胞可促進星形膠質細胞分化，而星形膠質細胞通過旁分泌細胞信號傳導反向調節小膠質細胞的表型，兩者相互調控影響血管發育和完整性。

常見的急性或者亞急性期的腦缺血損傷會破壞腦微血管系統，并導致隨后的炎癥反應，伴隨著神經元損傷加劇和小膠質細胞激活。缺血性中風的臨床研究表明，在中風的不同病理進程階段均能檢測到小膠質細胞的活化[14]。小膠質細胞在腦微血管周圍募集，導致血管崩解及CD68的表達上調。已有的靶向小膠質細胞的藥物——米諾環素和其他小膠質細胞活化抑制劑已顯示出腦缺血損傷后神經保護效應[15-16]。但是圍繞缺血性中風中小膠質細胞的雙向調節作用仍具有爭議，因此，靶向小膠質細胞的臨床應用還需要更多的探索工作。

小膠質細胞的過度活化作用同樣是研究熱點，一般研究認為，促炎性的小膠質細胞對機體有害，具有反向調控作用[14]。膿毒性腦病中血管炎癥引起的白細胞黏附與小膠質細胞過度活化存在細胞間關聯。王等[17]使用活體雙光子激光掃描技術結合免疫印跡和免疫熒光方法，發現膿毒癥小鼠進行盲腸結扎和穿刺(cecal ligation and puncture，CLP)誘導后，嘌呤受體配體門控離子通道7(purinergic receptor，ligand gated ion channel 7，P2RX7)激活使小膠質細胞活化并募集至具有炎癥反應的腦微血管處，與粘附的白細胞相鄰。進而驗證了趨化因子配體受體CX3CL1-CX3CR1信號參與小膠質細胞趨化和活化的基礎細胞間通訊。該項研究表明，CLP模型中P2RX7途徑的阻斷有助于降低小膠質細胞活化和神經血管損傷，由此揭示了膿毒癥腦病中的小膠質細胞介導的炎癥反應與神經元損傷之間存在級聯反應[17]。值得注意的是，這種級聯反應的中間媒介細胞類型，是腦微血管內皮細胞。此外，小膠質細胞也通過P2RX7信號轉導參與阿爾茨海默癥的血管病理機制，藥理抑制P2RX7信號作用可有效改善Aβ誘導的病癥表現。以上證據揭示了神經元、小膠質細胞與腦微血管細胞間存在不同類型細胞間的級聯信號傳導，小膠質細胞在神經血管耦聯中的雙向調節作用機制是亟待明確的重要分子事件，將為臨床治療提供關鍵思路。

2.4 腦血管內皮細胞-周細胞的細胞間通訊模式腦血管自身調節和肌原性張力可調節靜息腦血流量水平，并可能促進神經血管耦合。血管平滑肌細胞對多種血管活性物質作出收縮和舒張反應，并對下游血管發出血管舒張刺激。在腦毛細血管中，周細胞充當了血管平滑肌的角色。部分周細胞通過收縮對大腦產生的血管活性信號產生反應，從而影響毛細血管直徑。一些研究表明，周細胞在建立和維持血管結構和BBB功能中必不可少。研究者利用Pdgfrb-Flp;Cspg4-FSF-CreER小鼠模型發現周細胞經白喉毒素的消融作用后，小鼠表現出急性的BBB破壞，引發嚴重的缺血和周細胞來源的多效生長因子(pleiotrophin)減少造成神經元的丟失[18]。這種快速的神經變性級聯反應將周細胞丟失。

在急性和慢性中樞神經系統疾病中都發現了周細胞的減少，在缺血性中風和腦外傷之后迅速凋亡[19]。多個研究報道了缺血性中風不同階段的周細胞系列變化行為[20]。在中風的急性期，周細胞通過收縮使毛細血管堵塞，引發血液無回流現象；然而有趣的是，隨后周細胞具有促炎和免疫調節作用，通過保護管腔外側的內皮細胞并釋放神經營養蛋白以穩定BBB并保護腦實質。此外，在中風后恢復階段，周細胞具有神經保護活性，促進血管再生與神經元生長。可見周細胞在缺血-再灌注損傷和修復的復雜過程中響應內皮細胞和神經元的動態變化，發揮著多重干預作用。

腦微血管周細胞同樣是BBB的關鍵組成部分，維持BBB屏障功能和促進血管重塑[21]。先前的發現表明，來自腦微血管的周細胞增強了原代培養的大鼠腦內皮細胞的BBB完整性[22]。研究首次證明了瞬時受體電位M2(transient receptor potential M2，TRPM2)的硝化作用誘導的自噬參與周細胞損傷的病理過程，明確了周細胞損傷的分子機制對于開發治療神經血管功能障礙相關病理的治療策略。TRPM2是氧化應激的傳感器，同時也具有調節內皮功能障礙和增加肺微血管滲透性等作用。研究者采用氧化鋅納米顆粒(zinc oxide nanoparticles，ZnO-NP)誘導的應激模型，免疫印跡實驗表明TRPM2的蛋白表達呈時間依賴性增加。接著，通過使用TUNEL染色發現ZnO-NP處理后TUNEL陽性周細胞比例增加，而經TRPM2-siRNA處理敲低TRPM2的表達可顯著抑制周細胞損傷期間的細胞凋亡和內質網應激反應。進一步實驗表明，ZnO-NP誘導引起的周細胞損傷分子事件與TRPM2的Y1485處酪氨酸硝化相關，同時靶向TRPM2-Y1485S的定點突變及敲除TRPM2均可降低周細胞損傷。TRPM2這一分子靶點對于開發治療神經血管功能障礙相關病理的治療策略具有關鍵意義[23]。

周細胞的募集和遷移增強了新形成毛細血管的成熟度和穩定性。G蛋白偶聯受體124(G protein-coupled receptor 124，GPR124)有助于維持神經系統中血管生成和BBB完整性，內皮特異的GPR124缺失可導致小鼠胚胎期死亡[24]。最新研究表明，微球栓塞誘導的微血管損傷缺血中，周細胞中的GPR124表達增加，特別是黏著斑處[25]。形態學分析顯示，GPR124在黏著斑處與肌動蛋白結合蛋白連接，并上調Cdc42的表達。實驗結果提示，5-氨基-3-(4-嗎啉基)-1,2,3-惡二唑(3-morpholino-sydnonimine，SIN-1)或糖氧剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)處理使GPR124重新分布到人腦血管周細胞的前邊緣，參與了絲狀偽足的形成，這對于缺血樣損傷情況下導致周細胞極化和遷移至關重要[25]。因此，周細胞中GPR124參與細胞遷移和分化，可能是涉及神經血管重建的腦部疾病的潛在治療靶標。基于神經血管耦聯學說，對腦缺血病理過程中GPR124介導的信號通路，其影響神經元和其他膠質細胞活化的時空變化規律還需進一步的研究。

3 展望

“神經血管單元”概念的提出是了解神經網絡與腦微血管結構間通訊重要理論基礎。神經網絡系統與血管網絡系統之間存在著雙向通訊，多種類型細胞的耦聯和精準通訊共同維持這兩個體系的結構重塑和功能調節。中樞神經系統的生理過程涉及神經元、血管和神經膠質細胞系統及多種分泌因子的相互協同作用。病理損傷時健康大腦功能所需的神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和血管細胞的平衡被破壞，影響血腦屏障通透性和完整性。這些不同類型的細胞在疾病的病理生理過程時空動態變化下，如何實現多維的精確調控以達到大腦能量和養分的代償性功能，是未來神經科學領域還需繼續探索的重要問題。

開展復雜腦疾病機制研究，需要我們摸清血管細胞與神經細胞的耦聯機制，探尋神經細胞通過信號介質影響多腦區功能的規律，拓寬中樞神經系統疾病的研究思路。當前腦部疾病的細胞間通訊規律研究需要結合生物化學和神經生物學多個領域的不同技術手段。神經血管領域的研究需要借助神經藥理基因編輯、神經電生理、光遺傳學和化學遺傳學等多種實驗方法準確探究實驗動物中目標基因或蛋白的生理功能及缺失后所產生的細胞間通訊異常病理效應。神經環路涉及眾多未知細胞和物質類型，神經遞質和細胞因子間的跨腦區通訊的實現依據仍需逐步明確。鑒于神經血管耦聯的復雜性，我們需要超越單一神經元的范疇去探究不同腦病中涉及的神經-血管網絡的細胞間分子信號傳導機制，進一步為開發有效的藥物靶標提供必要的依據。