紅景天苷調(diào)控KLF4/eNOS信號抑制Hcy誘導內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用

何 麗，涂夢欣，黃 梅，彭劍青，姜 豐，沈祥春，張彥燕

(貴州醫(yī)科大學 1.藥學院臨床藥學教研室、2.天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

研究表明，血管內(nèi)皮功能損傷介導血管內(nèi)皮細胞生物學功能的改變，其中內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)是影響其生物學功能的主要環(huán)節(jié)[1]。內(nèi)皮細胞在特殊生理或病理條件下，可逐漸丟失原有的內(nèi)皮表型，表現(xiàn)為內(nèi)皮標志物如CD31、血管內(nèi)皮黏蛋白(VE-cadherin)等的表達減少，同時獲得間充質(zhì)細胞表型，表達如α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)等標志物的上調(diào)，細胞的增殖、遷移與分泌能力進一步增強，此過程稱之為EndMT[2]，是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病情推進演變的重要病理過程[3]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性降低及一氧化氮(NO)生物利用度的下調(diào)，已成為內(nèi)皮功能損傷的顯著特征[4]。eNOS為內(nèi)皮細胞合成NO的關(guān)鍵酶，在EndMT介導的AS疾病中涉及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達變化[5]，故eNOS/NO信號軸參與EndMT過程中對血管功能的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)通過與特定DNA序列特異性結(jié)合，對細胞生命活動的各個過程起到調(diào)節(jié)作用。近年來發(fā)現(xiàn)，Krüpple樣因子(Krüpple like factors，KLFs)為參與調(diào)節(jié)重要生命過程的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其中Krüpple樣因子4(Krüpple like factor 4，KLF4)具有調(diào)控細胞增殖、表型差異及重塑細胞骨架等作用[6,7]。因此，本研究擬基于KLF4/eNOS信號開展內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的研究工作。

紅景天苷(salidroside，SAL)是景天科(Crassulaceae)紅景天屬植物紅景天的主要有效成分。研究表明，SAL可抑制血管內(nèi)皮細胞氧化應激、炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并延緩內(nèi)皮細胞衰老，具有明確保護心血管系統(tǒng)的藥理作用[8-10]。前期研究表明，紅景天苷可上調(diào)Hcy 誘導的內(nèi)皮細胞抗氧化信號Nrf2 的表達，改善內(nèi)皮細胞氧化應激損傷，提示SAL具有潛在保護內(nèi)皮細胞的作用[11]。本研究基于KLF4/eNOS信號途徑，分析SAL對Hcy誘導內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用，以期為中藥藥效成分紅景天苷的血管藥理學活性提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)購于美國Sciencell公司，批號19195。

1.2 試劑紅景天苷購自西亞化學工業(yè)有限公司(純度≥98%，批號：B19208)；內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基、細胞凍存液購自美國Sciencell公司(批號：26219、19671)；VE-cadherin、α-SMA、KLF4、eNOS抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司(批號分別為：#2500、#19245、#4038、#9572)；GAPDH抗體購自Bioworld公司(批號：MB001)；BCA蛋白定量試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司(批號：P0010)；電化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購自美國Millpore公司(批號：1829501)；siRNA由上海吉瑪基因科技有限公司提供(對照siRNA正義：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。KLF4 siRNA正義：5′-GGACUUUAUUCUCUCCAAUTT-3′，反義：5′-AUUGGAGAGAAUAAAGUCCTT-3′)。

1.3 儀器DMi1倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；170-3930型垂直電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；CFX型凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)HUVECs培養(yǎng)于含5%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的雙抗、1%內(nèi)皮細胞生長因子的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中，視細胞生長情況換液及傳代。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染采用siRNA技術(shù)實現(xiàn)內(nèi)皮細胞KLF4的沉默。待細胞生長融合至60%左右進行轉(zhuǎn)染，以無血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 2000，配制siRNA-lipofectamin復合物，細胞轉(zhuǎn)染6 h后轉(zhuǎn)為正常條件培養(yǎng)24 h，采用蛋白免疫印跡法檢測轉(zhuǎn)染效率。

2.3 細胞處理與分組第一部分實驗研究SAL對Hcy誘導內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的作用，分為正常對照組(Control)、模型組(Model，1 mmol·L-1Hcy)、SAL低劑量組(1 mmol·L-1Hcy +10 μmol·L-1SAL)、SAL高劑量組(1 mmol·L-1Hcy +50 μmol·L-1SAL)。各給藥組以SAL預孵育2 h后，加入Hcy共孵育48 h誘導EndMT。第二部分實驗通過siRNA技術(shù)實現(xiàn)內(nèi)皮細胞KLF4的沉默，基于KLF4/eNOS信號分析SAL抑制EndMT的分子機制。分為正常對照組(Control)、模型組(Model，1 mmol·L-1Hcy)、SAL組(1 mmol·L-1Hcy +50 μmol·L-1SAL)、siKLF4組(1 mmol·L-1Hcy+siKLF4)、siKLF4+SAL共給藥組(1 mmol·L-1Hcy+siKLF4+50 μmol·L-1SAL)。轉(zhuǎn)染處理方法按2.2項下方法進行，各處理組預孵育2 h后給予Hcy共孵育48 h復制EndMT。

2.4 Western blot檢測相關(guān)信號的蛋白表達收集各實驗組細胞，加入細胞裂解液(PMSF ∶RIPA=1 ∶99)于冰浴提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，以30 μg的蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。濕轉(zhuǎn)至0.45 μm的PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。分別加入一抗于4 ℃孵育過夜，洗膜后加入稀釋的二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h。1×TBST洗膜后，增強型ECL液暗室顯影。Image Lab 5.1 軟件分析目的蛋白相對表達量。

2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力將細胞接種于六孔板，按2.3項下第一部分實驗分組處理細胞，采用10 μL移液槍垂直劃痕，PBS洗滌后采用無血清培養(yǎng)基給藥處理，倒置顯微鏡下拍照。隨機選取5個點，分析SAL對細胞遷移力的影響。遷移率/%=(0 h劃痕距離平均值-12 h劃痕距離平均值)/0 h劃痕距離平均值×100%。

2.6 試劑盒檢測NO的含量將HUVECs接種于培養(yǎng)板，按2.3項下第一部分實驗分組處理細胞，依試劑盒說明書方法檢測細胞培養(yǎng)上清液中NO的含量。

2.7 KLF4 siRNA干擾實驗將HUVECs接種于六孔板培養(yǎng)，待細胞生長密度約為60%左右，按2.2項下內(nèi)容分組處理，采用Western blot檢測KLF4的蛋白表達。

2.8 細胞免疫熒光技術(shù)檢測KLF4的表達采用細胞免疫熒光技術(shù)分析KLF4的表達。按2.3項下第二部分實驗方法分組處理細胞至觀察終點，細胞經(jīng)PBS 洗滌，以4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌，加入Triton-X 100透化10 min，PBS洗滌，加入山羊血清封閉1 h。分別加入特異性熒光標記的一抗(稀釋比例1 ∶50)，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌后加入對應的熒光二抗(稀釋比例1 ∶1 000)，孵育1h，PBS洗滌，然后加入DAPI染核5 min，PBS洗滌后加入抗熒光淬滅劑，于倒置熒光顯微鏡下拍照，觀察KLF4的表達情況。

3 結(jié)果

3.1 SAL對Hcy誘導EndMT表型標志物表達的影響Western blot 結(jié)果表明，Hcy誘導HUVECs內(nèi)皮標志物VE-cadherin的表達減少(P<0.05)，間充質(zhì)標志物α-SMA 表達顯著增加(P<0.01)；SAL低、高劑量預孵育可上調(diào)內(nèi)皮細胞VE-Cadherin的水平(P<0.05)，下調(diào)α-SMA的水平(P<0.05，P<0.01)，如Fig 1所示。結(jié)果表明，SAL預處理可抑制Hcy誘導內(nèi)皮細胞表型標志物的變化。

Fig 1 Effects of SAL on expression of EndMT-related *P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group

3.2 SAL對Hcy誘導細胞遷移能力的影響劃痕修復實驗結(jié)果表明，與正常對照組比較，Hcy顯著誘導細胞遷移率增加為(150.69±21.97)%(P<0.01)；經(jīng)SAL低、高劑量預處理后，細胞的遷移率分別為(137.79±11.42)%和(105.58±10.44)%(P<0.01)，提示SAL預處理可降低Hcy誘導的細胞遷移能力，如Fig 2所示。

3.3 SAL對Hcy誘導的細胞eNOS/NO信號軸的影響采用Western blot檢測各實驗組eNOS的蛋白水平，硝酸還原酶法檢測細胞培養(yǎng)上清液NO的含量。Hcy誘導內(nèi)皮細胞eNOS的蛋白表達降低(P<0.01)，NO的水平減少(P<0.05)。SAL預孵育可上調(diào)eNOS的表達，提高內(nèi)皮舒張因子NO的含量，如Fig 3和Tab 1所示。結(jié)果提示，SAL預給藥可上調(diào)eNOS/NO信號軸的水平，改善內(nèi)皮功能損傷。

Tab 1 Effect of SAL on Hcy-induced NO

Fig 2 Effect of SAL on migration of **P<0.01 vs control group;##P<0.01,ns vs model group

3.4 SAL對Hcy誘導的細胞KLF4表達的影響Western blot結(jié)果表明，SAL低、高劑量組預給藥可明顯降低Hcy誘導的內(nèi)皮細胞KLF4的表達水平。細胞免疫熒光分析結(jié)果進一步表明，與正常對照組比較，Hcy可誘導核轉(zhuǎn)錄因子KLF4由胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位，50 μmol·L-1的SAL預處理可降低KLF4的熒光強度，抑制KLF4的核轉(zhuǎn)位，如Fig 4所示。結(jié)果證實，SAL有效降低核轉(zhuǎn)錄因子KLF4的表達水平，并抑制KLF4的核轉(zhuǎn)位。

3.5 SAL和沉默KLF4對Hcy誘導的EndMT表型標志物及KLF4/eNOS信號表達的影響為明確KLF4能否作為上游信號調(diào)節(jié)eNOS的水平，參與調(diào)控Hcy誘導的EndMT，實驗采用siRNA技術(shù)實現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞KLF4的敲低表達。結(jié)果表明，與正常組比較，sicontrol組KLF4的表達沒有發(fā)生變化(P>0.05)；與sicontrol組相比，siKLF4轉(zhuǎn)染組顯著抑制核轉(zhuǎn)錄因子KLF4的表達水平(P<0.01)，證實本實驗體系成功實現(xiàn)內(nèi)皮細胞KLF4的沉默，見Fig 5A。Western blot 結(jié)果表明，Hcy誘導內(nèi)皮細胞KLF4和間充質(zhì)標志物α-SMA 表達增加(P<0.01)，eNOS及內(nèi)皮標志物VE-cadherin的表達減少(P<0.01，P<0.05)；SAL組和siKLF4組均可上調(diào)Hcy誘導的HUVECs中eNOS和VE-Cadherin的表達，抑制KLF4和α-SMA的表達，見Fig 5B-C。與SAL+siKLF4的共處理組比較，SAL組及siKLF4組對表型標志物的作用無明顯差異，結(jié)果提示，KLF4可能為SAL抑制Hcy誘導EndMT的重要信號，且KLF4可作為上游信號調(diào)節(jié)eNOS的表達。結(jié)果證實，紅景天苷可通過調(diào)節(jié)KLF4/eNOS信號途徑的表達水平，抑制Hcy誘導的EndMT。

Fig 3 Effect of SAL on eNOS expression in HUVECs induced by n=3)**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group.

Fig 4 Effect of SAL on expression of KLF4 in HUVECs induced by n=3)**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs model group.

Fig 5 Effects of SAL and KLF4 silencing on expression of EndMT-related markers,KLF4 and eNOS induced by Hcy n=3)*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group;ns vs siKLF4 group or SAL group.

4 討論

EndMT是內(nèi)皮細胞在內(nèi)、外損傷因素的作用下向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化的特殊狀態(tài)，其可通過影響內(nèi)皮細胞的屏障及分泌功能惡化內(nèi)皮微環(huán)境，加劇內(nèi)皮功能障礙[12]。大量研究顯示，內(nèi)皮功能障礙伴隨eNOS/NO信號通路的表達變化，在高同型半胱氨酸血癥導致內(nèi)皮功能障礙中起到關(guān)鍵作用[13-14]。NO為強效的內(nèi)皮舒張因子，主要由L-精氨酸在一氧化氮合酶eNOS的催化下生成，內(nèi)皮細胞生成釋放的NO經(jīng)擴散至血管中層平滑肌細胞后，經(jīng)激活鳥苷酸環(huán)化酶介導血管平滑肌的舒張效應，從而調(diào)節(jié)血管舒張功能，故eNOS/NO信號軸已成為血管藥理學研究的重要分子信號[15-16]。課題組前期研究表明，沉默內(nèi)皮細胞KLF4的表達可抑制TGF-β誘導的細胞增殖、遷移及表型差異，有效抑制EndMT，證實KLF4為EndMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17]。目前，雖然開展了大量eNOS/NO信號途徑的研究工作，但基于轉(zhuǎn)錄因子KLF4調(diào)節(jié)eNOS/NO信號軸的研究鮮見報道，因此本研究基于KLF4/eNOS信號途徑，開展EndMT介導血管內(nèi)皮功能損傷的研究。

研究表明，內(nèi)皮細胞功能損傷為動脈粥樣硬化的始動環(huán)節(jié)，積極尋找以保護血管內(nèi)皮細胞功能為靶標，逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細胞生物學功能障礙的創(chuàng)新藥物，對防治動脈粥樣硬化具有重要意義。前期研究中，我們已證實紅景天苷可上調(diào)抗氧化信號Nrf2 的表達，改善Hcy誘導的內(nèi)皮細胞氧化應激損傷，初步明確了其血管藥理學活性[11]。本研究以Hcy誘導的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化為切入點，圍繞轉(zhuǎn)錄因子KLF4對eNOS/NO通路的影響，分析紅景天苷對EndMT的作用及分子機制，明確藥物的血管藥理學活性。結(jié)果表明，與正常對照組相比，Hcy誘導孵育48h明顯降低了內(nèi)皮特異性標志物VE-cadherin的水平、上調(diào)間充質(zhì)細胞標志物α-SMA的表達，增強細胞遷移力，表明Hcy顯著誘導EndMT。經(jīng)低、高劑量SAL預處理，可抑制細胞表型標志物的變化，降低細胞遷移能力，證實SAL有效抑制EndMT，且作用與上調(diào)eNOS/NO信號通路的水平，下調(diào)KLF4的蛋白表達有一定關(guān)系。采用細胞免疫熒光實驗觀察KLF4在內(nèi)皮細胞的表達定位，揭示SAL可抑制KLF4由細胞質(zhì)向胞核轉(zhuǎn)位，由此表明SAL干預EndMT的作用機制與抑制轉(zhuǎn)錄因子KLF4的活性相關(guān)。為進一步研究轉(zhuǎn)錄因子KLF4對eNOS/NO信號的調(diào)節(jié)作用，系統(tǒng)分析SAL抑制EndMT的分子機制，我們采用siRNA干擾技術(shù)實現(xiàn)內(nèi)皮細胞KLF4的沉默。實驗結(jié)果顯示，沉默KLF4可上調(diào)細胞eNOS/NO信號的水平，提示KLF4可能為調(diào)節(jié)eNOS的上游分子信號參與調(diào)節(jié)血管舒張功能。經(jīng)組間比較，SAL組、siKLF4組及SAL+siKLF4共給藥組對細胞表型標志物VE-cadherin及α-SMA的表達水平無明顯差異，表明KLF4可為SAL抑制EndMT的關(guān)鍵分子靶點。因此，本研究首次報道了紅景天苷通過調(diào)節(jié)KLF4/eNOS信號途徑，抑制Hcy誘導EndMT的作用，但其確切信號轉(zhuǎn)導機制還有待深入研究。