外源2,4-表油菜素內酯對鎘脅迫下草地早熟禾葉綠素代謝的影響

朱瑞婷， 牛奎舉， 張娣君， 楊 陽， 宋 云， 馬暉玲

(甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 甘肅省草業工程實驗室， 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

鎘(Cadmium，Cd)污染是最為普遍的重金屬污染，對植物、動物和人類健康具有潛在的危害[1]。植物修復技術可用于去除土壤中的重金屬，該技術成本低廉、環境友好，是土壤重金屬修復研究中的熱點問題，應用前景廣泛[2-4]。目前已發現多種Cd超積累植物，如天藍遏藍菜(Thlaspicaerulescens)、東南景天(Sedumalfredii)和龍葵(Solanumnigrum)等[5-6]，但已發現的超富集植物多為一年生植物，且生物量小，不適于我國北方寒旱地區種植[7]。相對而言，草坪草具有氣候環境適應性強，根系致密，多年生，耐地修剪等優點，可以迅速地覆蓋地表，防止重金屬通過水或風的侵蝕遷移到別處，這些優點使草坪草比其他超富集植物在修復鎘污染土壤上具有顯著的優越性[7-8]。已有研究表明，草地早熟禾(Poapratensis)、高羊茅(Festucaelata)和多年生黑麥草(Loliumperenne)等冷季型草坪草對Cd具有較強的耐受和富集能力，在80 mg·kg-1Cd處理下，草地早熟禾對土壤Cd的萃取率高達4.64%,而超富集植物龍葵只有0.43%[9-10]。因此，研究Cd脅迫下草坪草生長發育的調控對利用其修復Cd污染土壤具有重要意義。

油菜素甾醇(Brassinosteroids,BRs)是植物體中發現的一類甾醇類植物激素，在植物的正常生長發育和對生物、非生物脅迫適應過程中起著重要作用[11]。2，4-表油菜素內酯(2,4-Epibrassinolide，EBR)是作為外源物質在植物上應用最多的BRs化合物之一[12]。研究表明，外源EBR對植物低溫[13]、高溫[14]、干旱[15]、鹽[16]和重金屬[17]脅迫損傷均具有一定的緩解效應。外源EBR可促進逆境脅迫下植物的生長發育,增加葉綠素含量、提高光合能力和增強抗氧化能力[12-15]。葉綠素代謝和植物的光合作用聯系密切，但關于外源EBR調控Cd脅迫下葉片的葉綠素合成和降解代謝的研究鮮有報道。

草地早熟禾具有較強的耐Cd性，Cd脅迫可降低草地早熟禾葉綠素含量[8]，但Cd脅迫對草地早熟禾葉綠素合成和降解代謝的影響尚不清楚。因此，本試驗以草地早熟禾‘午夜’為研究材料，對Cd脅迫和不同濃度EBR處理下的植株葉綠素合成中間產物和葉綠素含量以及葉綠素合成和降解通路相關基因的相對表達水平進行了測定，旨在揭示Cd脅迫下草地早熟禾葉綠素代謝的響應及外源EBR對Cd脅迫下植物葉綠素代謝的調控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為草地早熟禾‘午夜’品種，來自北京克勞沃公司。

1.2 試驗處理

將種子播種在直徑為9 cm、高度為17 cm的育苗缽中，每組10盆。育苗缽中為營養土、蛭石和沙子，其比例為2∶1∶1，在生長室中培養。生長條件為：白天溫度為25℃，時間為16 h，光照強度為6 000 lux，夜晚溫度為20℃，時間為8 h，濕度為50%。待幼苗長45 d左右后，選擇長勢一致的幼苗移栽到水培盒中。移栽7 d后的草地早熟禾植株進行不同濃度的EBR噴施處理和Cd脅迫處理，處理共有5組：(1)CK，Hoagland營養液培養；(2)Cd，含0.5 mM CdCl2·1/2 H20的Hoagland營養液培養(0.114 g CdCl2·1/2 H20溶于1 L Hoagland營養液中)；(3)Cd+5 nM EBR，含0.5 mM CdCl2·1/2 H20的Hoagland營養液培養和5 nM的2，4-油菜素內酯預處理；(4)Cd+50 nM EBR，含0.5 mM CdCl2·1/2 H20的Hoagland營養液培養和50 nM的2，4-油菜素內酯預處理；(5)Cd+100 nM EBR，含0.5 mM CdCl2·1/2 H20的Hoagland營養液培養和100 nM的2,4-油菜素內酯預處理。EBR預處理是指在Cd脅迫開始的前3 d對草地早熟禾葉片噴施不同濃度EBR的處理，CK和Cd處理組噴施相同體積的蒸餾水。Cd脅迫處理后1 d，3 d，6 d時采集各處理組草地早熟禾葉片，每處理組4次重復。

1.3 光合色素及葉綠素合成前體物質含量的測定

葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量用乙醇-丙酮浸提法測定[18-19]，稱取0.2 g新鮮葉片，將其浸入10 mL提取液中，提取液為乙醇和丙酮溶液(體積比為1∶1)，黑暗靜置24 h后搖勻，在波長645 nm，652 nm和663 nm下測定吸光值A，并計算出其物質含量。

采用Hodgins和Van Huystee (1986) 的方法[20]測定原卟啉Ⅳ(ProtoⅣ)、鎂-原卟啉Ⅳ(Mg-ProtoⅣ)和原葉綠素酸酯(Pchl)的含量。稱0.2 g新鮮葉片，分3次加入10 mL的提取液，提取液為丙酮和1%的氨水溶液(體積比為4∶1)，冰浴充分研磨后在4℃，12 000 r·min-1下離心18 min，離心結束后吸取上清液分別在不同的波長(575 nm，590 nm和628 nm)下測定吸光值A，并計算其物質含量。

1.4 葉綠素代謝途徑相關基因的表達

葉片RNA提取使用天根公司植物RNA提取試劑盒，RNA反轉錄使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect real time)試劑盒，第一步為去除基因組DNA反應，第二步為反轉錄合成cDNA，稀釋20倍作為模板。根據水稻(oryzasativaL.)葉綠體合成酶相關基因的登錄號，將本實驗室已有和報道的草地早熟禾轉錄組數據庫作為本地數據庫[21-22]，查找與葉綠素合成酶相關的基因系列，使用NCBI在線網站Prime-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)進行引物設計，設計的引物由蘭州天啟基因生物科技有限公司合成(表1)。表中基因為膽色素原脫氨酶(PpPBGD)、原葉綠素酸酯氧化還原酶(PpPOX)、葉綠素酶(PpCLH)、脫鎂葉綠酸a氧化酶(PpPAO)、5-氨基酮戊酸脫水酶(PpALAD)、紅色葉綠素分解代謝物還原酶(PpRCCR)、脫鎂葉綠素酶(PpPPH)、谷氨酰tRNA合成酶(PpGTS)、Mg-螯合酶D亞基(PpCHLD)、Mg-螯合酶Ⅰ亞基(PpCHLI)。利用試劑盒進行qRT-PCR分析，熒光定量試劑盒來自北京擎科新興生物技術有限公司。20 μL反應體系如下：模板5 μL，引物1.6 μL，ddH2O 3.4 μL，2×TSINGKE Master Qpcr Mix 10 μL。熒光定量PCR的反應程序為：95℃預變性1 min，50個循環的PCR擴增，包括95℃變性10 s和60℃退火30 s，60℃時采集熒光信號。內參基因為PpACT，每個樣品設3次技術重復，基因的相對表達量使用2-ΔΔCT法計算[23]。

表1 葉綠素合成相關基因的引物系列

1.5 數據分析

使用Excel 2019統計和整理試驗數據，利用SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析，假定方差齊性選擇LSD和Duncan，顯著性水平為0.05，并用GraphPad Prism 8軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源EBR對Cd脅迫下草地早熟禾葉綠素含量的影響

由圖1可知，Cd處理的草地早熟禾葉片的葉綠素a含量在1 d和6 d時顯著低于對照(CK)(P<0.05)，葉綠素b含量在1 d和6 d時高于CK，但差異不顯著。在Cd脅迫處理的第3 d，草地早熟禾葉片的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量與CK無顯著性差異。在脅迫處理的第6 d，Cd處理的草地早熟禾葉片的葉綠素a和總葉綠素含量較CK分別下降了54.80%和33.23%，葉綠素b較CK增加了14.51%。5 nM和50 nM EBR處理的草地早熟禾葉片的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量在Cd脅迫期間(1～6 d)與CK無顯著性差異。在Cd脅迫6 d時，100 nM EBR處理的草地早熟禾葉片的葉綠素a和總葉綠素含量顯著低于CK(P<0.05)，但其含量仍高于Cd處理，說明外源EBR可緩解Cd脅迫導致的草地早熟禾葉片的葉綠素a和總葉綠素含量的降低。

圖1 外源EBR對鎘脅迫下草地早熟禾葉片的葉綠素a(A)、葉綠素b(B)和總葉綠素含量(C)的影響

2.2 外源EBR對Cd脅迫下草地早熟禾葉綠素合成前體物質含量的影響

如圖2所示，Cd處理的草地早熟禾葉片的原卟啉Ⅳ、鎂-原卟啉Ⅳ和原葉綠素酸酯含量均顯著低于CK(P<0.05)。在Cd脅迫1 d時，草地早熟禾葉片的原卟啉Ⅳ和鎂-原卟啉Ⅳ含量的下降幅度最大，分別較CK下降了37.99%和34.36%；在Cd脅迫3 d時，草地早熟禾葉片的原葉綠素酸酯含量的下降幅度最大，較CK下降了34.57%；Cd處理的草地早熟禾葉片的鎂-原卟啉Ⅳ和原葉綠素酸酯含量在6 d時下降幅度最小。

外源添加5 ～100 nM EBR可減緩Cd脅迫下草地早熟禾葉片的原卟啉Ⅳ、鎂-原卟啉Ⅳ和原葉綠素酸酯含量的下降幅度(圖2)。50 nM EBR處理的草地早熟禾葉片的原卟啉Ⅳ含量在脅迫期間(1～6 d)均顯著高于Cd處理(P<0.05)，脅迫處理6 d與CK無顯著性差異。在Cd脅迫3 d時，5 ～100 nM EBR處理的草地早熟禾葉片的鎂-原卟啉Ⅳ和原葉綠素酸酯含量顯著高于Cd處理(P<0.05)，50 nM EBR處理下與CK無顯著性差異，說明外源EBR可緩解Cd脅迫導致的草地早熟禾葉片的葉綠素合成前體物質含量的降低。

2.3 外源EBR對Cd脅迫下草地早熟禾葉綠素合成通路基因表達的影響

PpGTS，PpALAD，PpPBGD，PpCHLD，PpCHLI和PpPOR基因編碼從谷氨酸到葉綠素a合成生物合成通路的關鍵酶，由圖3可知，Cd處理1 d后可下調PpPBGD，PpCHLD，PpCHLI和PpPOR基因的表達(P<0.05)，而PpGTS和PpALAD基因表達水平無明顯變化。在Cd處理3 d時，PpGTS，PpALAD，PpPBGD和PpCHLD基因表達水平與CK相比無顯著性差異;而在第6 d，Cd處理可誘導PpGTS,PpALAD,PpPBGD和PpPOR基因的上調表達(P<0.05)。該結果說明草地早熟禾葉綠素合成通路基因在短期Cd脅迫下被下調表達，而長期的Cd脅迫可在轉錄水平上誘導葉綠素合成通路基因的上調表達。

圖2 外源EBR對鎘脅迫下草地早熟禾葉片的鎂-原卟啉Ⅳ(A)、原葉綠素酸酯(B)和原卟啉Ⅳ含量(C)的影響

外源EBR處理可誘導Cd脅迫下草地早熟禾葉綠素合成通路基因的上調表達(圖3)。50 nM EBR處理在Cd脅迫1 d可誘導PpGTS,PpALAD,PpPBGD和PpPOR基因的上調表達(P<0.05)。Cd脅迫3 d時，100 nM EBR處理可誘導PpGTS,PpALAD和PpCHLD基因的上調表達(P<0.05)，而50 nM EBR處理可誘導PpCHLI和PpPOR基因的上調表達(P<0.05)。Cd脅迫6 d時，5 ～100 nM EBR處理的草地早熟禾PpGTS,PpALAD,PpCHLD和PpCHLI基因表達水平與Cd處理無顯著性差異，而PpPBGD和PpPOR基因被誘導上調表達(P<0.05)，其中5，50和100 nM EBR處理的PpPOR基因相對表達量分別是Cd處理9.3，4.7和9.4倍，這說明外源EBR可在轉錄水平上促進Cd脅迫下草地早熟禾葉綠素生物合成通路。

2.4 外源EBR對Cd脅迫下草地早熟禾葉綠素降解通路基因表達的影響

PpCLH,PpPPH,PpPAO和PpRCCR是葉綠素降解通路的關鍵基因。如圖4所示，Cd處理1 d后，PpCLH和PpPPH基因表達水平無明顯變化，PpPAO和PpRCCR基因被誘導上調表達(P<0.05)，而Cd處理6 d后，PpCLH,PpPPH,PpPAO和PpRCCR基因均被誘導上調表達(P<0.05)，其表達水平分別是CK的18.5,12.4,63.5和14.1倍。在Cd脅迫3 d和6 d，外源添加50～100 nM EBR的草地早熟禾PpCLH，PpPPH和PpPAO基因的表達量低于Cd處理(P<0.05)，50 nM EBR處理的PpRCCR基因表達水平在第1 d和6 d均低于Cd處理(P<0.05)。這說明Cd脅迫可在轉錄水平上誘導葉綠素降解，而外源的EBR添加可在一定程度上抑制Cd脅迫引起的葉綠素降解。

圖3 外源EBR對鎘脅迫下草地早熟禾葉綠素合成通路基因表達的影響

圖4 外源EBR對鎘脅迫下草地早熟禾葉綠素降解通路基因表達的影響

3 討論

3.1 草地早熟禾葉綠素代謝對Cd脅迫的響應

在高等植物中，光合色素主要包括葉綠素(葉綠素a、葉綠素 b)和類胡蘿卜素，干旱、高溫和重金屬等非生物脅迫常導致植物光合色素含量的下降和內囊體膜結構的損傷，進而使得光合能力下降[24-26]。本研究結果表明，Cd脅迫可顯著地降低草地早熟禾葉片的葉綠素a和總葉綠素含量。葉綠素的含量的降低可能是由于葉綠素中間產物的轉化過程受到了阻礙葉綠素的生物合成，進而導致葉綠素含量降低[27-29]，也有可能是由于葉綠素的降解所導致的[30]。Cd脅迫下植物葉綠素含量降低的原因尚不清楚，因此，本研究對Cd脅迫下草地早熟禾葉片的葉綠素合成和降解途徑都進行了研究。

高等植物葉綠素的生物合成通路主要是：甘氨酸→5-氨基乙酰丙酸→膽色素原→尿卟啉原III→原卟啉Ⅳ→鎂-原卟啉Ⅳ→原葉綠素酸酯→葉綠素a[31-32]，該過程是由一系列關鍵酶的催化反應完成的，編碼這些酶基因表達的下調可導致酶活性的降低，進而使得該過程的催化反應受阻，降低受阻位點之后的中間產物[33]。前人研究結果表明，高溫、干旱和鹽堿等逆境脅迫可導致植物葉綠素合成途徑受阻[27-29]。本研究對編碼葉綠素生物合成通路的關鍵酶基因進行了分析，發現Cd脅迫初期草地早熟禾PpGTS和PpALAD基因表達水平無明顯變化，但PpPBGD，PpCHLD，PpCHLI和PpPOR均被誘導下調表達，其中PpPBGD基因編碼酶催化從膽色素原到尿卟啉原III的轉化過程，說明Cd脅迫可能導致該轉化過程受阻。向麗霞等[28]發現高溫脅迫下番茄(Solanumlycopersicum)幼苗葉綠素的合成受阻位點是膽色素原到尿卟啉原III的轉化過程，可造成原卟啉Ⅳ、鎂-原卟啉、原葉綠素酸酯和葉綠素a的降低，這與本研究結果一致。本研究發現Cd處理的草地早熟禾葉片的鎂-原卟啉Ⅳ和原葉綠素酸酯含量在脅迫6 d時較CK下降幅度有所減小，這可能與PpPBGD和PpPOR基因在脅迫后期的上調表達有關，但Cd處理葉綠素a和總葉綠素含量在6 d時的降幅最大，這說明Cd脅迫后期葉綠素含量的降低可能與葉綠素的降解有關。

植物葉片衰老過程中的葉綠素降解過程包括：葉綠素酶催化的葉綠素去植醇基反應；脫鎂葉綠素酶催化的去除鎂離子反應；脫鎂葉綠素酸氧化酶催化的卟啉氧化降解反應；紅色葉綠素分解代謝物還原酶催化熒光葉綠素降解中間產物的分解代謝[34]。PpCLH，PpPPH，PpPAO和PpRCCR基因分別編碼上述4個步驟的關鍵酶[35]。在高溫誘導的匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)葉片衰老過程中，葉綠素酶(CLH)和脫鎂葉綠素酶(PPH)活性顯著增高[26]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)PPH基因的缺失突變體表現出滯綠的表型，其葉片衰老過程中葉綠素不能夠被降解[36]。此外，在小麥(Triticumaestivum)、黃瓜(Cucumissativus)和辣椒(Capsicumannuum)等農作物上的研究表明，低溫、高溫、鹽和干旱等非生物脅迫均可誘導PAO和RCCR基因的上調表達[37-39]。本研究表明Cd處理可誘導PpCLH，PpPPH，PpPAO和PpRCCR基因的上調表達，說明Cd脅迫引起葉綠素的降解。

3.2 外源EBR對Cd脅迫下草地早熟禾葉綠素代謝的調控

外源EBR可通過調節植物的生理代謝過程及生長發育來提高植物在干旱、鹽堿、高溫和重金屬等逆境脅迫的能力[14-17]。已有研究表明外源EBR具有提高逆境脅迫下葉綠素含量的作用[12,16]。Peng等[40]發現外源EBR可提高Cd脅迫下Cd超富集植物龍葵葉片的葉綠素含量。本研究亦發現外源EBR可緩解Cd脅迫導致的草地早熟禾葉綠素a和總葉綠素含量的降低，這說明外源EBR可能對草地早熟禾葉綠素生物合成或者降解途徑具有一定的調控作用。

BZR1基因是BRs信號轉導途徑下游重要的轉錄因子，可通過調控相應靶標基因的表達來調控不同的生物學過程[41]，番茄BZR1基因沉默株系可引起葉綠素的降解[42]。光敏色素作用因子(PIFs)也參與BR信號的調控網絡，BZR1-PIF4復合體可調控植物的生物學過程，BZR1也可通過DELLA蛋白與PIF1,PIF3和PIF3互作[43]。已有研究表明，PIF1基因可介導POR基因的表達而直接調控擬南芥葉片葉綠素的生物合成[44]。本研究外源EBR可顯著誘導Cd脅迫下草地早熟禾PpPOR基因的上調表達。這說明外源EBR可能是通過BR信號途徑介導PIF來調控Cd脅迫下草地早熟禾葉綠素的生物合成。外源EBR可在一定程度上誘導草地早熟禾葉片的葉綠素a合成通路其他關鍵基因的上調表達，進一步緩解Cd脅迫對草地早熟禾葉片葉綠素合成中間產物及葉綠素含量的抑制，同時，外源EBR可抑制Cd脅迫誘導的葉綠素降解代謝相關基因上調表達。Peng等[40]研究發現外源EBR可誘導逆境脅迫下龍葵葉片葉綠素合成基因的上調表達和降解通路基因的下調表達，這與本研究結果相似。然而，有關外源EBR是如何調控葉綠素合成和降解通路基因的問題有待進一步的研究。

4 結論

Cd脅迫初期，草地早熟禾葉片的葉綠素合成前體物質原卟啉Ⅳ、鎂-原卟啉Ⅳ和原葉綠素酸酯含量與CK相比顯著降低，PpPBGD,PpCHLD,PpCHLI和PpPOR基因下調表達，葉綠素降解基因PpCLH,PpPPH,PpPAO和PpRCCR基因上調表達，葉綠素a和總葉綠素的含量顯著下降。外源5 ～100 nM EBR處理可顯著提高Cd脅迫下草地早熟禾葉片的鎂-原卟啉Ⅳ和原葉綠素酸酯含量，其中50 nM的EBR可顯著提高Cd脅迫下原卟啉Ⅳ、鎂-原卟啉Ⅳ、原葉綠素酸酯葉綠素a和總葉綠素的含量，誘導Cd脅迫下草地早熟禾葉綠素合成通路基因的上調表達，使Cd脅迫下草地早熟禾葉片的葉綠素含量恢復到正常水平。