基于形態特征和SSR標記的斑茅繁殖策略的研究

安金嬋， 常 丹， 白史且， 陳智華， 鄢家俊， 張建波， 李達旭，游明鴻，毛德才， 王 艷， 楊金平， 李英主， 邱文靜

(1.西南民族大學， 四川 成都 610041；2.四川省草原科學研究院， 四川 成都 611731)

繁育系統是指所有直接影響其后代遺傳組成的有性特征，包括花的綜合特性、花部各器官的壽命、傳粉方式、自交親和程度和交配系統等[1]。其中交配系統至關重要，它控制基因通過配子體傳遞了兩代間遺傳信息，決定了后代的基因型分布，對物種的遺傳變異水平和自然種群的遺傳組成產生深遠的影響[2]。因此了解植物繁殖特性對于確定遺傳育種和植物保護制定至關重要[3-4]。

人們研究植物繁殖性狀主要是從物候學、形態特征和人工授粉試驗中推斷出來的[5-6]。如觀測其物候期、傳粉特性、雜交指數以及套袋試驗等指標來推測植物的交配系統[7-9]。但是，這些指標的測量只能推測異交和自交的相對程度，不能反映植物自然群體的真實異交率。隨著科技的發展，分子標記的使用克服了這些困難，分子標記不受外界環境和植物生長發育階段的影響[10]，被廣泛用于研究和確定植物交配系統。簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)標記因其重復性好、操作簡便、高效和多態性，已成為一種應用廣泛的分子標記工具[11]。根據遺傳標記估計的交配系統參數有助于特定植物物種保護策略和育種選擇方式的發展。

斑茅(Saccharumarundinaceum)是甘蔗屬(Saccharum)密叢高大草本植物，適應性強，廣泛種植在我國南方荒山荒坡、鹽堿地、沿海灘涂等地。其種內變異豐富、抗旱抗蟲耐貧瘠性強、分蘗多、生長快，有較強的生態競爭能力[12-13]，在緩解能源供給緊張的同時，對改善我國生態環境具有重要意義。其優異性狀特點也倍受甘蔗(Saccharumofficinarum)育種者的普遍關注，對高產高糖甘蔗品種的培育有重要意義。但是，由于斑茅花期普遍比甘蔗早3～6個月[14]，使得斑茅優良特性的利用率低下，且斑茅-甘蔗雜交困難。目前國內外對斑茅植物的研究主要集中在種質資源的調查及評價、形態學、細胞學、蛋白質標記、遺傳多樣性及種質資源抗逆性的研究等方面[15]，對斑茅植物生殖生物學方面試驗性研究還未見報道。而植物學性狀與分子標記兩者相結合才能選出最佳育種材料，達到預期的育種目標[16]。故本研究以收集自我國7省的45份野生斑茅為研究對象，對斑茅表型特征和交配系統進行研究，以期闡明斑茅的繁殖特性及其有性繁殖力的情況，為斑茅資源的開發利用、保護、雜交育種及繁殖技術提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自四川省成都市大邑縣韓場鎮種質資源圃(30°25′ N，103°45′ E)，該資源圃收集了來自我國陜西、四川、貴州、廣西、云南、廣東、海南7省的野生無性系斑茅種質資源(四川省草原科學研究院提供)，于2012年移栽，植株高大健壯，平均株高 4.5 m。共有45個居群(如表1)，每個居群種于一個長8 m寬5 m的地塊中，每個地塊包含12個無性系單株。

1.2 方法

1.2.1花粉量與花粉-胚珠比P/O 采用血球計數法[17]統計斑茅花粉量。從每個斑茅居群中隨機選取3個單株進行標記，每株選擇3個即將開放的小花，放入1.5 mL離心管中，帶回實驗室。將離心管中的花藥搗碎，加入0.1 mL 1.0 mol·L-1的鹽酸對花藥進行水解一個小時，用移液槍吸取約0.01 mL 進行制片，在顯微鏡(10×)(OLYMPUS-BX53F，日本)下直接觀察記錄5個大方格的數值(血球計數板計數池長寬各3.0 mm，分為9個大方格，每個大方格容積為0.1 mm3)，記錄數值A，1朵花的花粉總數=0.1×A/(0.5×10-3×3)=200A/3。檢測一朵小花的胚珠數，P/O=1朵小花花粉量/一朵小花的胚珠數。根據Cruden[18]標準(P/O為2.7～5.4時，其繁育系統為閉花受精；P/O為18.1～39.0時，繁育系統為專性自交；P/O為31.9～396.0時，繁育系統為兼性自交；P/O為244.7～2 588.0時，繁育系統為兼性異交；P/O為2 108.0～195 525.0時，繁育系統為專性異交)來判斷斑茅的交配系統。

1.2.2花粉活力與花粉壽命 采用TTC法[19]測定花粉活性：選擇即將開放的斑茅小花采集花藥，將花藥撒于載玻片上，滴加0.1%的TTC染液進行染色，后于顯微鏡下統計被染色和未被染色的花粉數目。計算花粉活力百分比。

隨機選取17個居群，每個居群選取3個單株抽穗2/3但未盛開的斑茅花穗無性系材料，剪取單株穗莖(帶葉片)帶回室內進行自來水養莖，從正在開放的花上收集一定量的花粉，每隔0.5 h用TTC染色，染成紅色的記為有活力的花粉，其余均記為無活力的花粉(由同一個人計數)，并計算花粉活力百分比，求出花粉最長存活時間，得出花粉壽命。

1.2.3雜交指數OCI(outcrossingindex)測定 每個居群選擇1個單株上的一條斑茅花穗進行花序直徑、花朵大小以及對雌雄蕊開花時期形態的觀測，按照Dafni[20]的標準進行OCI值的評估，并進行繁育系統評判。

表1 斑茅材料采集地及其海拔、經緯度

①采用游標卡尺測量花序直徑，花序直徑<1 mm記為0；1～2 mm記為1；2～6 mm記為2；>6 mm記為3。

②花藥開裂時間與柱頭可授期之間的時間間隔，采用聯苯胺-過氧化氫法[18](V1%聯苯胺∶V3%過氧化氫∶V水=4∶11∶22)對開花前的柱頭進行可授性的鑒定，同時于顯微鏡下觀測柱頭周圍是否有花粉粒，雌蕊先熟記為0；雄蕊先熟記為1。

③柱頭與花藥的空間位置，同一高度記為0；空間分離記為1。

三者之和為OCI值。之后依據OCI值進行繁育系統的判定。其標準為：OCI=0，閉花受精；OCI=1時，專性自交；OCI=2時，兼性自交；OCI=3時，自交親和，有時需要傳粉者；OCI=4時，部分自交親和、異交、需要傳粉者；OCI=5時為專性異交。

1.2.4柱頭可授性檢測 用聯苯胺-過氧化氫法[21](V1%聯苯胺∶V3%過氧化氫∶V水=4∶11∶22)對斑茅開花前一天、開花時刻、開花后幾天進行柱頭可授性測定。取斑茅柱頭浸入含有聯苯胺-過氧化氫溶液的凹面載玻片上，其周圍溶液出現藍色及有氣泡產生，則證明柱頭具有可授性。

1.2.5SSR分子標記研究交配系統 在45個居群中，對有30個子代以上的母株及其子代進行SSR比較分析。母株取野生無性系斑茅居群中的單株進行樣本測定，子代由母株收集而來的種子經發芽育苗后進行測定。共采集15個居群39個半同胞家系材料(39個單株在開放授粉狀態下每個單株上收獲的種子形成的個體集合)，每個家系30個子代，除去育苗及試驗過程中的損耗，共獲得1 158個子代苗。該15個居群均為6倍體無性系材料。

基因組DNA的提取:DNA采用Plant Gneomic DNA Kit方法提取。采用2%的瓊脂糖凝膠測定其質量，紫外分光光度計測定濃度，用無菌水稀釋濃度為20 ng·μL-1，存放至-80℃冰箱備用。

引物的篩選:參照Zhang等[22]發表的SSR引物，選取5個樣本對引物進行篩選，篩選出如表2所示11對擴增條帶清晰、多態性好、穩定性高的引物進行試驗。

表2 用于斑茅DNA擴增的11對SSR引物及其退火溫度

PCR擴增：PCR擴增采用20 μL體系，包括0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，10 μL 2×Reaction Mix，1.5 μL 0.1 μg·μL-1模板DNA，最后用ddH2O補足。

擴增反應在PCR東勝(ETC811)擴增儀上進行，擴增程序為95℃預變形5 min，94℃變性30 S，退火45 S，72℃延伸45 S，33個循環；72℃延伸5 min，4℃保存。擴增產物以DL2000 Marker對照，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，150 V電壓下電泳2 h，最后拍照。

SSR數據分析：本研究采用多位點混合交配系統模型估計多位點異交率和單位點異交率[23]。多位點異交率又稱為異交率的多位點估計，在估計時它考慮到了確定性的異交，也考慮到了檢測不到但確定已出現的異交。使用Excel對PCR擴增數據進行整理記錄其基因型。MLTR3.4[24]統計軟件對交配系統進行各參數的計算。在親本基因型已知的情況下，采用最大期望值法，在95%的置信區間，選擇家系內1 000次重復取樣，估算多位點異交率(tm)，單位點異交率(ts)，雙親近交系數(tm—ts)和親本近交系數(F)。

2 結果與分析

2.1 花粉量與胚珠比

隨機對20個斑茅居群的花粉量進行了測定，發現斑茅1朵小花中的3個花藥的總花粉量平均為5 897，1朵小花的胚珠數為1。因此，斑茅的花粉量與胚珠比為5 897，根據Cruden[15]的標準判斷，斑茅屬于專性異交。

2.2 花粉活力與花粉壽命

如表3所示，種群上斑茅花粉活力從開花時刻到開花后3小時，花粉活力逐漸減弱。從開花時刻的44.49%到開花后1小時35.61%再到開花后3小時的6.72%，結果表明斑茅花粉活力較低，且花粉壽命時間約為3個小時，大大限制了花粉的傳粉效率。

表3 花藥離體后花粉活性率

2.3 柱頭可授性檢測

用聯苯胺-過氧化氫法對斑茅開花前一天，開花時刻、開花后幾天進行柱頭可授性測定。結果如圖1所示，斑茅在開花前一天就具有可授性，到開花時刻柱頭可授性最強，之后幾天柱頭可授性持續下降，到開花后第5天，斑茅柱頭可授性趨近于無。表明斑茅柱頭可授期不是限制斑茅有性生殖的影響因素。

圖1 不同時期斑茅柱頭可授性

2.4 雜交指數

如表4所示，斑茅開花后平均花序直徑為1.18±0.08 mm。在開花前一天柱頭就具有可授性，開花前一天在柱頭周圍觀察到了少量的花粉粒，證明在開花前花藥就有輕微的開裂，故雌雄蕊同時成熟。柱頭與花藥空間位置分離，所以雜交指數(OCI)為2，根據Dafni[17]的標準判斷斑茅繁育系統屬于兼性自交。

表4 斑茅雜交指數OCI

2.5 SSR分子標記研究交配系統

PCR擴增產物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，部分電泳圖如圖2所示。對電泳條帶進行數據讀取，利用MLTR3.4軟件對斑茅無性系隨機抽取的15個居群中的39個半同胞家系母本單株和1 158個子代進行交配系統評估(表5)，結果如下：11個位點估算出多位點異交率(tm)為0.864，單位點異交率(ts)為0.853，自交率(s)為0.136，表明斑茅種群具有較高的異交率水平，同時存在一部分的自交；多位點異交率相關系數(rt)為0.455，多位點父本相關性(rP(m))為0.132，有效花粉供體數目為7.6，也進一步表明斑茅種群具有一定比例的自交；親本近交系數(F)為0.318，大于0，表明有過剩的純合子，近交優勢較大；近交衰退系數(δ)為-4.144，表明斑茅沒有明顯的近交衰退現象。

圖2 引物L27在部分母本與其子代中的PCR擴增結果

表5 斑茅種群水平上的交配系統參數評估

利用MLTR3.4對斑茅家系進行交配系統分析發現(表6)，與在斑茅種群水平上的結果不同，雖然都具有較高的異交率，但居群家系中斑茅多位點異交率變化差異較大(tm=0.601～1.200)，單位點異交率同樣表現出較大差異(ts=0.575～1.200)。1，13，25，27，48，54，57號家系雙親近交系數<0，說明居群家系間無近親交配現象。其余居群家系間有較輕程度的近交現象，其中E26號居群雙親近交系數最大。

表6 斑茅15個居群交配系統參數

3 討論和結論

雜交指數、花粉量與胚珠比在研究植物繁育系統中廣泛使用。本研究中，P/O為5 897，根據Cruden的標準[24]進行歸類分析，斑茅屬于專性異交。斑茅的大花粉量符合其多年生禾本科風媒植物的特性[25]，其結果也與楊等[14]統計斑茅花粉量大致相同。OCI指數為2，根據Dafni的標準[19]，斑茅繁育系統為以自交為主的混合交配系統，與本研究P/O結果具有一定的重合性。

斑茅花粉活力低，平均花粉活性百分率僅為44.49%，該結果與雷敬超[26]連續7年對同一屬的甘蔗花粉活力測定的結果相似。花粉離體后活力迅速下降，壽命約為3個小時，大大限制了花粉的傳粉時間、距離和傳粉效率，所以花粉的初始活力可能是影響斑茅自交結實率低的一個因素。花的壽命是植物繁殖的一個關鍵特征，它平衡了花粉的傳播速度與花的維護成本。柱頭可授性的時間長短對于植物花期來說是極為重要的，它對植物的授粉成功率和結果有一定的影響[27-28]。柱頭可授性結果顯示斑茅柱頭在開花前就具有柱頭可授性，且柱頭可授性時間長，比同一屬的甘蔗柱頭可授性時間略短[29]。這一結果與趙元杰等[22]對芒的花粉壽命與柱頭可授性結果相一致。它彌補了花粉離體后活力迅速下降這一劣勢，對異花傳粉植物的傳粉成功率有一定的影響[30-31]，不是影響斑茅有性生殖的限制因素。

本研究對斑茅居群的異交率進行了評估。統計交配系統參數時，Ritland和Jain[24]認為多數情況下采用3～6個共顯性位點即可得到準確的結果，我們比較了采用6個位點和11個位點統計斑茅異交率，結果發現兩種情況下異交率相差不大。這一結果與孫小涵等[32]采用3個位點與9個位點統計荊條的異交率結果相似。雙親近交系數(tm—ts)反映了雙親自交的程度，斑茅異交率處于較高水平(tm=0.853)，tm—ts>0，表明斑茅居群存在自交。這一結果可能與斑茅的居群密度、風力和花期不完全同步，先開花的植株未能更多地接受異源的花粉有一定聯系[33-34]。斑茅多位點異交率相關系數較大(rt=0.445)，親本近交系數F>0，說明在該斑茅居群中異交占較大優勢，且和隨機交配相比，近交會產生較多的純合子[35]。Tm>(1—F)/(1+F)表明斑茅種群偏離哈迪-溫伯格平衡，導致其偏離的原因可能與近交、氣候、單株密度、營養繁殖等有關[36]。不同斑茅家系也都具有較高的異交率，但異交率水平存在較大差異(tm=0.601～1.200)，這可能是親本的自交可育程度，花粉的活性，資源圃中的位置以及其材料來源生境所致。

綜合花粉與胚珠比P/O、雜交指數、斑茅傳粉特征及交配系統結果，本研究初步認為斑茅的繁殖特性為異交為主，自交為輔的兼性異交模式。