鉀肥對(duì)紫花苜蓿根頸丙二醛、可溶性蛋白含量與抗氧化系統(tǒng)的影響

陳衛(wèi)東， 張玉霞*， 叢百明， 阿瑪爾， 田永雷， 張慶昕，杜曉艷

(1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 通遼 028041； 2. 通遼市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所， 內(nèi)蒙古 通遼 028000； 3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

鉀是植物體內(nèi)多種酶的催化劑，具有促進(jìn)植物體內(nèi)酶促反應(yīng)的功能[1]。我國(guó)北方土壤的鉀肥含量比南方略高，但依舊嚴(yán)重不足[2]，尤其是沙性土壤。土壤鉀素含量不足影響植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，從而導(dǎo)致植物的產(chǎn)量、品質(zhì)下降，施用鉀肥可以增強(qiáng)植物抗性、促進(jìn)生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量和品質(zhì)[3-4]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，是世界上種植面積最大的牧草之一[5]。苜蓿對(duì)氮肥要求不高，但需要施用磷、鉀等肥料，苜蓿對(duì)鉀的需求量高于其他任何一種元素[6-12]。

鉀肥能夠提高苜蓿的抗寒性[13]，合理施用鉀肥，對(duì)苜蓿越冬具有重要的作用。前人關(guān)于苜蓿抗寒的機(jī)理研究較多，認(rèn)為維持活性氧代謝平衡是苜蓿抗寒生理機(jī)制之一[14]，目前關(guān)于鉀肥是否能夠提高苜蓿的抗氧化特性、不同鉀肥種類及用量之間是否存在差異尚不清楚。因此，秋季對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行硫酸鉀和氯化鉀施肥量處理，越冬前期挖取苜蓿越冬器官，進(jìn)行4℃和—20℃溫度處理，研究苜蓿根頸丙二醛含量、抗氧化酶活性、可溶性蛋白含量的變化，分析苜蓿在不同鉀肥種類及施用量處理下適應(yīng)低溫冷凍的抗氧化生理機(jī)理，確定在科爾沁沙地秋季施用鉀肥的最佳種類及施用量，為科爾沁沙地苜蓿制定秋季鉀肥施用方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古通遼市內(nèi)蒙古民族大學(xué)科技示范園區(qū)(43°36′ N，122°22′ E)，海拔高度為177 m，年平均氣溫 6.4℃，≥10℃年活動(dòng)積溫3 184℃，年平均日照時(shí)數(shù)3 000 h左右，無(wú)霜期150 d左右，年平均降水量379.1 mm，蒸發(fā)量是降水量的5倍左右，年平均風(fēng)速3～4 m·s-1，為典型的溫帶大陸性季風(fēng)氣候。試驗(yàn)田土壤為沙土，新開(kāi)墾沙化草地，土壤0～20 cm，p H值為8.3，土壤有機(jī)質(zhì)含量為0.640%，全氮含量為0.036%，堿解氮含量為35.37 mg·kg-1，速效鉀含量為77.51 mg·kg-1，速效磷含量為3.70 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試苜蓿材料為‘北極熊’紫花苜蓿品種，由北京百斯特草業(yè)有限公司提供。試驗(yàn)材料于2018年7月17日進(jìn)行播種，播種量22.5 kg·hm-2，條播行距 15 cm，播種前撒施磷酸二銨150 kg·hm-2，苜蓿生長(zhǎng)過(guò)程中進(jìn)行適時(shí)噴灌、除草、防治病蟲(chóng)害等田間管理。8月20日采用溝施方式施用不同種類和不同水平的鉀肥，鉀肥為K2SO4(K2O含量50%)和KCl(K2O含量為60%)，施用量設(shè)0，50，100，150，200 kg·hm-25個(gè)鉀肥(K2O)施用水平，即K2SO4的施用量分別為0，100，200，300，400 kg·hm-2，KCl的施用量分別為0，83.3，166.7，250，333.3 kg·hm-2，分別用K0，K1，K2，K3，K4表示。采用二因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，共30個(gè)小區(qū)，小區(qū)種植面積4 m×5 m，四周設(shè)保護(hù)行。于封凍期前(11月15日)取樣，挖取苜蓿越冬器官，每小區(qū)取材料50株(粗細(xì)均勻一致)，平均分成2份，其中1份放在冰箱中4℃(溫度誤差=±1℃)低溫冷藏，另1份于程序式低溫處理箱模擬低溫處理。處理時(shí)采用脫脂棉包裹，加水適量，再用錫紙包裹，注明編號(hào)，處理溫度為—20℃的低溫處理，以0℃為起點(diǎn)，4℃·h-1的速率降溫，到達(dá)設(shè)定溫度后保持6 h，然后按照4℃·h-1的速率升溫至4℃，取出置于4℃下保持12 h，然后進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

參考鄒琦[15]的方法測(cè)定生理指標(biāo)，其中丙二醛(malondialdehyde,MDA) 含量采用硫代巴比妥酸法，過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD) 采用愈創(chuàng)木酚法，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD) 采用氮藍(lán)四唑法，過(guò)氧化氫酶(cata lase,CAT) 采用紫外吸收法，可溶性蛋白(solublr protein,SP)采用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS軟件進(jìn)行二因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性分析，Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、作圖以及制作表格。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉀肥對(duì)紫花苜蓿根頸丙二醛(MDA)含量的影響

如表1所示，越冬前期挖取的苜蓿越冬材料在4℃溫度處理下，不同鉀肥種類及用量之間的MDA含量無(wú)顯著性差異。但經(jīng)—20℃低溫冷凍處理后，MDA含量明顯增加，K2SO4的K0，K1，K2，K3，K4施用量處理MDA含量分別較4℃處理增加了100.0%，83.8%，43.8%，6.3%，35.9%，KCl的K0，K1，K2，K3，K4施用量處理分別較4℃處理增加了100.0%，100.0%，62.7%，29.1%，54.4%，說(shuō)明低溫冷凍處理較冷藏處理，苜蓿根頸膜脂過(guò)氧化嚴(yán)重。

-20℃低溫冷凍處理下，KCl的不同施用量處理的MDA含量顯著高于K2SO4處理，在兩種鉀肥處理下，K0與K1的MDA含量無(wú)顯著差異，但顯著高于K2，K3，K4處理(P<0.05)，K3處理的MDA含量顯著低于K0及其他施鉀量處理(P<0.05)。由此說(shuō)明秋季施用鉀肥能夠提高苜蓿的抗寒性，且K2SO4強(qiáng)于KCl，施用量以150 kg·hm-2(K2O)為宜。

2.2 鉀肥對(duì)紫花苜蓿根頸超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

如表2所示，越冬前期挖取的苜蓿越冬材料在4℃溫度處理下，不同鉀肥種類及用量之間的SOD活性無(wú)顯著性差異。但經(jīng)—20℃低溫冷凍處理后，SOD活性明顯增強(qiáng)，K2SO4的K0，K1，K2，K3，K4鉀肥用量處理SOD活性分別較4℃處理增加了15.2%，9.0%，27.7%，72.7%，56.0%，KCl的K0，K1，K2，K3，K4鉀肥用量處理分別較4℃處理增加了15.2%，13.3%，21.9%，62.3%，31.7%，說(shuō)明低溫冷凍處理活性氧大量產(chǎn)生，苜蓿通過(guò)增強(qiáng)SOD酶活性提高抗氧化特性，但不同鉀肥種類及用量之間存在差異。

—20℃低溫冷凍處理下，K2SO4不同鉀肥用量處理顯著高于KCl不同鉀肥用量處理(除K1處理)(P<0.05)，兩種鉀肥處理下，K0與K1差異不顯著，但K0顯著低于其他鉀肥用量處理(P<0.05)，兩種鉀肥處理下K3的SOD活性均顯著高于其他鉀肥用量處理(P<0.05)。由此說(shuō)明秋季施用鉀肥能夠提高苜蓿在低溫冷凍處理下SOD活性，且K2SO4強(qiáng)于KCl，施用量以150 kg·hm-2(K2O)下SOD活性最強(qiáng)。

2.3 鉀肥對(duì)紫花苜蓿根頸過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響

如表3所示，越冬前期挖取的苜蓿越冬材料在4℃處理下，不同鉀肥種類及用量之間的POD活性無(wú)顯著性差異，但經(jīng)—20℃低溫處理后，POD活性明顯增加，K2SO4的K0，K1，K2，K3，K4鉀肥用量處理POD活性分別較4℃處理增加了9.0%，31.4%，38.6%，103.1%，66.3%，KCl的K0，K1，K2，K3，K4鉀肥用量處理分別較4℃處理增加了9.0%，15.5%，24.6%，94.6%，50.9%，說(shuō)明在低溫冷凍處理過(guò)氧化物大量產(chǎn)生，苜蓿通過(guò)增強(qiáng)POD酶活性提高抗氧化特性，且不同鉀肥種類及用量之間存在差異。

—20℃低溫冷凍處理下，K2SO4不同鉀肥用量處理POD酶活性顯著高于KCl不同鉀肥用量處理(P<0.05)，K2SO4處理下，不同鉀肥施用量處理均顯著高于K0(P<0.05)，KCl處理下，K0與K1差異不顯著，但K0顯著低于其他鉀肥用量處理(P<0.05)，兩種鉀肥處理下K3的POD活性均顯著高于其他鉀肥用量處理(P<0.05)。由此說(shuō)明秋季施用鉀肥能夠提高苜蓿在低溫冷凍處理下POD活性，且K2SO4強(qiáng)于KCl，施用量以150 kg·hm-2(K2O)為POD活性最強(qiáng)。

表2 不同鉀肥種類及施用量下紫花苜蓿根頸SOD活性變化

表3 不同鉀肥種類及施用量下紫花苜蓿根頸POD活性變化

2.4 鉀肥對(duì)紫花苜蓿根頸過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響

如表4所示，越冬前期挖取的苜蓿越冬材料在4℃處理下，不同鉀肥種類及用量之間的CAT活性無(wú)顯著性差異，但經(jīng)-20℃低溫處理后，CAT活性明顯增加，K2SO4的K0，K1，K2，K3，K4鉀肥用量處理CAT活性分別較4℃處理增加了1.6%，32.2%，34.2%，79.1%，34.1%，KCl的K0，K1，K2，K3，K4鉀肥用量處理分別較4℃處理增加了1.6%，3.6%，23.8%，47.8%，8.2%，說(shuō)明低溫冷凍處理過(guò)氧化氫大量產(chǎn)生，苜蓿通過(guò)增強(qiáng)CAT酶活性提高抗氧化特性，但不同鉀肥種類及用量之間存在差異。

-20℃低溫冷凍處理下，K2SO4不同鉀肥用量處理顯著高于KCl不同鉀肥用量處理(P<0.05)，兩種鉀肥處理下，K0與K1差異不顯著，但K0顯著低于其他鉀肥用量處理(P<0.05)，兩種鉀肥處理下K3的CAT活性均顯著高于其他鉀肥用量處理(P<0.05)。由此說(shuō)明秋季施用鉀肥能夠提高苜蓿在低溫冷凍處理下CAT活性，且K2SO4強(qiáng)于KCl，施用量以150 kg·hm-2(K2O)為CAT活性最強(qiáng)。

表4 不同鉀肥種類及施用量下紫花苜蓿根頸CAT活性的變化

2.5 鉀肥對(duì)紫花苜蓿根頸可溶性蛋白(SP)含量的影響

如表5所示，越冬前期挖取的苜蓿越冬材料，在4℃處理下，不同鉀肥種類及用量之間的可溶性蛋白含量無(wú)顯著性差異，但經(jīng)—20℃低溫冷凍處理后，SP含量明顯增加，K2SO4的K0，K1，K2，K3，K4鉀肥用量處理SP含量分別較4℃處理增加了6.9%，17.2%，38.0%，64.5%，39.1%，KCl的K0，K1，K2，K3，K4鉀肥用量處理SP含量分別較4℃處理增加了6.9%，5.1%，21.8%，38.9%，24.3%，說(shuō)明低溫冷凍下，苜蓿通過(guò)提高SP含量提高抗寒性，且不同鉀肥種類及用量之間存在差異。

—20℃低溫冷凍處理下，K2SO4不同鉀肥用量處理的SP含量顯著高于KCl不同鉀肥用量處理(P<0.05)，兩種鉀肥處理下，K0顯著低于其他鉀肥用量處理(除KCl的K1處理)(P<0.05)，兩種鉀肥處理下K3的SP含量均顯著高于其他鉀肥用量處理(P<0.05)。由此說(shuō)明秋季施用鉀肥能夠提高苜蓿在低溫冷凍處理下SP含量，且K2SO4強(qiáng)于KCl，施用量以150 kg·hm-2(K2O)為SP含量最高。

表5 不同鉀肥種類及施用量下紫花苜蓿根頸SP含量的變化

2.6 丙二醛與根頸中抗氧化酶活性及SP含量的相關(guān)性分析

如表6所示，越冬前期挖取的苜蓿越冬材料在4℃處理下，不同鉀肥種類及施用量之間的MDA含量與抗氧化酶活性、可溶性蛋白相關(guān)性均不顯著，但在—20℃低溫處理下，不同鉀肥種類及施用量之間的MDA含量與POD，SOD活性及SP含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，K2SO4處理的MDA含量與CAT活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，KCl處理的MDA含量與CAT活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。這表明POD，SOD，CAT活性越高，SP含量越高，MDA含量越低，苜蓿根頸受傷程度越輕，說(shuō)明鉀肥能夠提高苜蓿在低溫冷凍處理下抗氧化酶的活性，抑制膜脂過(guò)氧化，提高苜蓿的抗寒性。

表6 MDA與苜蓿根頸中抗氧化酶活性及SP含量的相關(guān)性

3 討論

當(dāng)植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)，細(xì)胞膜首先受到損傷，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，細(xì)胞內(nèi)溶物外滲，并積累膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA[16]。MDA是膜質(zhì)過(guò)氧化分解的重要產(chǎn)物，能夠和蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，MDA的積累可以對(duì)細(xì)胞再次造成傷害，進(jìn)而導(dǎo)致一系列生理生化反應(yīng)[17]，在一定程度上其含量的高低可以表示細(xì)胞的膜質(zhì)過(guò)氧化水平和細(xì)胞受損程度[18]。因此MDA是判斷植物受脅迫程度的重要指標(biāo)，MDA含量越高，植物受到損傷程度越大。本研究結(jié)果表明，低溫冷凍(—20℃)與常溫(4℃)處理相比，顯著提高了苜蓿根頸MDA的含量。申曉慧等[19]研究表明，苜蓿根系MDA含量隨著氣溫下降而升高，本試驗(yàn)與其結(jié)果一致，而在冷凍脅迫下施用鉀肥可以顯著降低MDA含量，說(shuō)明鉀肥對(duì)冷凍脅迫下細(xì)胞膜損傷有一定緩解作用，從而減輕冷凍脅迫對(duì)苜蓿根頸造成的傷害。其中施用300 kg·hm-2的K2SO4更能降低MDA含量，表明秋季施用300 kg·hm-2的K2SO4有利于提高苜蓿的抗寒性。

4 結(jié)論

綜上所述，常溫(4℃)條件下，秋季施用鉀肥與未施用鉀肥相比，苜蓿根頸中MDA，SP含量及POD，SOD，CAT活性均無(wú)顯著性差異；低溫冷凍(-20℃)條件下，MDA含量增加，苜蓿根頸受到損傷，刺激POD，SOD，CAT活性增強(qiáng)，SP含量增加，適應(yīng)低溫環(huán)境能力變強(qiáng)；在施用K2SO4300 kg·hm-2時(shí)，MDA含量最低，POD，SOD，CAT活性最強(qiáng)，SP含量最高，表明受傷程度最小，保護(hù)能力最強(qiáng)。因此建議在科爾沁沙地，秋季施用300 kg·hm-2的K2SO4有利于苜蓿安全越冬。