提升間充質(zhì)干細(xì)胞制劑保存穩(wěn)定性的有效途徑

劉福京

摘 要：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能夠應(yīng)用于遺傳缺陷性疾病、衰老性疾病、放射性疾病或組織器官損傷等一系列病癥的治療，在臨床上具有顯著的治療效果，其穩(wěn)定性將直接影響治療的安全性和有效性。將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑分別放置于室溫（23 ℃）和4 ℃條件下，于0、2、4、6、8、10、12和24 h抽樣，以探究提升臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑穩(wěn)定性的條件，為其日后的保存、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)提供科學(xué)的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑;保存;穩(wěn)定性;溫度

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如能夠自我更新、有效調(diào)節(jié)免疫功能等，且該干細(xì)胞來(lái)源十分豐富，容易培養(yǎng)。就目前已有的醫(yī)學(xué)研究來(lái)看，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑已經(jīng)得到廣泛使用，涵蓋了神經(jīng)系統(tǒng)疾病、各項(xiàng)器官組織的損壞以及自身免疫性疾病等，不僅大大提升了各類器官移植的成功率，還有效減少了患者器官移植后的排斥反應(yīng)，在臨床上具有不可忽視的應(yīng)用價(jià)值[1]。

由于受到多方面因素的影響以及不同患者治療方案的復(fù)雜性，制備干細(xì)胞制劑的技術(shù)在具體的操作過(guò)程中需要綜合考慮多方面因素。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)先后出臺(tái)了關(guān)于干細(xì)胞應(yīng)用的指導(dǎo)原則和操作規(guī)范，為干細(xì)胞的臨床治療提供了安全性基礎(chǔ)。在現(xiàn)實(shí)生活中，由于多方面原因，制備的干細(xì)胞并不能夠立即培養(yǎng)和應(yīng)用，所以必須加強(qiáng)對(duì)干細(xì)胞保存穩(wěn)定性的研究，以此來(lái)提升細(xì)胞的活性和成活率。我國(guó)發(fā)布的《干細(xì)胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則》中明確提出，要確定干細(xì)胞制劑的穩(wěn)定性及有效期，因此研究間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的穩(wěn)定性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[2]。

1 ? ?實(shí)驗(yàn)方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)步驟

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞主要是通過(guò)臍帶組織塊貼壁培養(yǎng)法分離和培養(yǎng)出來(lái)的，本研究培養(yǎng)提取臍帶組織塊后，將其放置于干細(xì)胞保存液中。干細(xì)胞保存液含有2%的人血白蛋白、65 IU/mL的低分子肝素鈣和復(fù)方電解質(zhì)注射液[3]。將其劃分為2組，分別放置于室溫（23 ℃）和4 ℃條件下保存，每組分為A，B，C 3個(gè)批次，并于0、2、4、6、8、10、12和24 h抽樣，制備人員用肉眼直接觀察后測(cè)定其細(xì)胞活率，一同實(shí)施無(wú)菌檢測(cè)，最終得出結(jié)果。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)檢測(cè)合格標(biāo)準(zhǔn)

（1）性狀：所有的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑通過(guò)直觀性檢測(cè)，均為無(wú)色均勻細(xì)胞懸液，無(wú)明顯沉淀，無(wú)異物。

（2）細(xì)胞活率檢測(cè)：對(duì)所有的間充質(zhì)干細(xì)胞制劑采取自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行快速測(cè)定，要求存活率不低于90%。

（3）無(wú)菌檢測(cè)：采用無(wú)菌檢測(cè)系統(tǒng)，將制劑上機(jī)培養(yǎng)7 d，結(jié)果顯示為陰性則合格[4]。

（4）計(jì)算細(xì)胞活率：采用計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，計(jì)算集中活細(xì)胞所占比例，每組重復(fù)5次之后取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以方差分析進(jìn)行組間數(shù)據(jù)平均值統(tǒng)計(jì)，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ?對(duì)比性狀、無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果

將A、B、C 3個(gè)批次的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑分別放置于兩種溫度下保存，不同保存時(shí)間的3個(gè)批次制劑形狀均沒(méi)有產(chǎn)生明顯變化，無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.2 ?細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果如表1所示，在室溫（23 ℃）條件下，A，B，C 3個(gè)批次樣品在0～6 h內(nèi)存活率緩慢降低，均高于90%;超過(guò)6 h后，A，B，C 3個(gè)批次樣品的細(xì)胞存活率降低較快，且低于90%，為不合格制劑。在4 ℃條件下保存24 h，A，B，C 3個(gè)批次樣品的細(xì)胞存活率均可以維持在90%以上，隨著保存時(shí)間的推移，存活率逐漸降低，保存前后的物理檢查及無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，均無(wú)異常。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的穩(wěn)定性主要是指其在實(shí)際存儲(chǔ)以及運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中，是否會(huì)出現(xiàn)物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)的改變，具體的檢測(cè)項(xiàng)目涵蓋細(xì)胞的形態(tài)、活性和存活率等多方面[5]。加強(qiáng)對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑穩(wěn)定性的檢測(cè)，關(guān)鍵在于干細(xì)胞數(shù)量和存活率的變化，能夠直接影響最終的使用療效。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有300多項(xiàng)關(guān)于干細(xì)胞的臨床實(shí)驗(yàn)研究，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞因其特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)應(yīng)用較為廣泛。利用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑進(jìn)行的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)、臨床移植治療等結(jié)果表明，不同臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的治療效果差別很大[6]。深入探究引發(fā)該現(xiàn)象的原因，最關(guān)鍵的因素就是臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的質(zhì)量差異，并受到疾病種類、使用劑量、治療時(shí)機(jī)以及對(duì)象的個(gè)體化差異等影響。造成臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑質(zhì)量差異的因素也有很多，具體涵蓋細(xì)胞來(lái)源的組織材料、制備過(guò)程、保存方法和操作人員技能水平等[7]。雖然國(guó)內(nèi)外已經(jīng)制定了對(duì)應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，但是由于多方面因素的影響，不同的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)出來(lái)的干細(xì)胞質(zhì)量差異較大，因此提升干細(xì)胞制劑的穩(wěn)定性十分重要[8]。

3 ? ?結(jié)語(yǔ)

間充質(zhì)干細(xì)胞制劑應(yīng)放置于4 ℃條件下保存，以此來(lái)維持其細(xì)胞存活率，并有針對(duì)性地結(jié)合運(yùn)輸條件、制劑配方、運(yùn)輸容器等創(chuàng)設(shè)合理的條件，提升制劑的穩(wěn)定性和治療效果。

[參考文獻(xiàn)]

[1]ZHAO J，YU G，CAI M，et al.Bibliometric analysis of global scientific activity on umbilical cord mesenchymal stem cells： a swiftly expanding and shifing focus[J].Stem Cell Research & Therapy，2018，9（1）：32.

[2]KIM Y.Can umbilical cord mesenchymal stem cells treat-ment be a hope for patients with refractory crohns disease[J].Gut Liver，2018，12（1）：5-6.

[3]WANG H，YAN X，JIANG Y，et al.The human umbilical cord stem cells improve the viability of 0A degenerated chon-drocytes[J].Molecular Medicine Reports，2018，17（3）：4474-4482.

[4]孫麗娟.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑制備及質(zhì)量控制[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，37（2）：171-175.

[5]婁云云.間充質(zhì)干細(xì)胞制劑保存穩(wěn)定性探索[J].生物化工，2018，4（3）：63-64.

[6]張鳳麗，邵小虎，任懷娟，等.低溫制劑保存對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響[J].中國(guó)組織工程研究，2017，21（33）：5255-5261.

[7]盧加琪，韋薇，劉伯寧，等.間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展與藥學(xué)評(píng)價(jià)[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2019，54（7）：1317-1324.

[8]張權(quán)，陳戀，饒巍，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的微生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)[J].重慶醫(yī)學(xué)，2020，49（12）：2003-2008.

Effective ways to improve the storage stability of mesenchymal stem cell preparations

Liu Fujing

（Shenzhen Cell-Bridge Biological Innovation Technology Co. Ltd.， Shenzhen 518000， China）

Abstract：Umbilical cord mesenchymal stem cells can be used in the treatment of a series of diseases such as genetic defect diseases， aging diseases， radiation diseases， or tissue and organ damage， and have significant clinical therapeutic effects. The stability of umbilical cord mesenchymal stem cell preparations can directly affect the safety and effectiveness of the treatment. Therefore， in this paper， the umbilical cord mesenchymal stem cell preparations were placed at room temperature（23 ℃）and 4 ℃， and samples were taken at 0， 2， 4， 6， 8， 10， 12 and 24 h to explore the improvement of umbilical cord mesenchymal stem cells. The conditions of the stability of the cytoplasmic stem cell preparation provide a scientific reference for the determination of its storage temperature.

Key words：umbilical cord mesenchymal stem cell preparation; storage; stability; temperature