β-欖香烯抗DDP 耐藥卵巢癌細胞SKOV3/DDP作用及機制研究

陳心蕊，周宋匯，汪瑞辰，許 麗

江蘇省腫瘤醫院，江蘇省腫瘤防治研究所，南京醫科大學附屬腫瘤醫院，南京 210009

卵巢癌是最常見的婦科腫瘤，由于其發病較為隱匿，大部分患者在確診時已經處于中晚期，因而卵巢癌致死率極高[1]，嚴重危害了女性的健康。當前對于卵巢癌的治療主要采用手術和化療的手段，而鉑類制劑依然是化療的主要藥物[2，3]，盡管化療前期能夠較好地殺傷腫瘤細胞，但是隨著使用周期的延長，腫瘤細胞極易產生順鉑（DDP）的耐藥性[4，5]，大大降低了臨床治療效果，降低患者生存期，因而探尋能夠逆轉卵巢癌的治療方法，是當前抗卵巢癌研究的熱點和難點。近年來，越來越多的文獻指出，中藥莪術中的β-欖香烯具有顯著的抗乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的活性[6]，更有研究表明，其具有逆轉結腸癌耐長春新堿的作用[7]，表明β-欖香烯可能成為一種良好增強化療藥物效應的藥物。相關理論認為，腫瘤細胞能夠通過多種方式產生化療藥物耐藥作用，其最主要的機制是腫瘤細胞通過表達多種蛋白、包括多藥耐藥性蛋白（ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）、肺耐藥相關蛋白（lung-resis-tance-related protein，LRP）和P-糖蛋白（P-gp），這些蛋白能夠直接與化療藥物結合，通過細胞胞吐作用將藥物轉運出細胞[8，9]。故而抑制耐藥蛋白的表達有望能夠逆轉卵巢癌的耐藥作用。本研究主要探討β-欖香烯對DDP 耐藥卵巢癌細胞SKOV3/DDP 的直接抑制效應，并研究其逆轉順鉑耐藥的作用，進一步對其作用機制進行探討。

1 材 料

1.1 腫瘤細胞株

SKOV3/DDP 耐藥卵巢癌細胞（江蘇凱基生物有限公司）。

1.2 藥品與試劑

McCoy’s 5a 細胞培養基（美國Hyclone 公司，批號：AC13430972）；胎牛血清（上海吉泰生物科技公司，批號：11H228）；β-欖香烯（成都植標化純生物技術有限公司，純度≥98%，批號：190627）；順鉑注射液（江蘇豪森藥物有限公司，批號：601191902，規格：1 mL 注射液含DDP 5 mg）；CCK-8 細胞活力檢測試劑（日本Dojindo 化學科技公司，批號：FH783）；細胞凋亡流式檢測試劑盒（江蘇凱基生物有限公司，批號：20191123）；ABCB1、LRP 和P-gp 蛋白一抗（美國CST 生物公司）；GAPDH 蛋白一抗（武漢三鷹生物公司）；蛋白二抗（南京巴傲德生物公司）；Ripa 蛋白裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒等（上海碧云天公司）。常規化學試劑，均為化學純，來源于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器

細胞培養二氧化碳孵箱（美國Thermo Fisher公司，型號：3110）；倒置顯微鏡（日本Olympus 公司，型號：CKX53）；多功能酶標儀（美國Thermo Fisher 公司，型號：Multiskan Fc）；流式細胞儀（美國BD 公司，型號：Accuri C6）；蛋白凝膠成像系統（美國Bio-RAD 公司，型號GelDoc）。

2 實驗方法

2.1 CCK-8 法檢測β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞增殖的影響

SKOV3/DDP 細胞采用含10%胎牛血清的Mc-Coy’s 5a 完全培養基進行培養，待細胞處于對數生長期時，采用胰酶消化、離心和計數，完全培養基重懸細胞計數板計數后，調整細胞濃度為2×105/mL，以每孔200 μL 體積接種于96 孔無菌細胞培養板中。細胞培養24 h 貼壁后，分別加入0、10、20、40、80、160、320 μmol·L-1的β-欖香烯于細胞培養板中，每個藥物組設置6 個復孔，繼續培養48 h。藥物作用結束后，每個細胞孔中加入10 μL 的CCK-8 溶液，輕輕敲擊培養板進行混勻，將培養板繼續置于培養箱中孵育2 h。孵育結束后，取出培養板置于酶標儀450 nm 波長處，檢測每孔的吸光度值A450。

細胞增殖抑制率（%）=（1-A藥物組/A對照組）×100%。

2.2 克隆形成實驗檢測β-欖香烯對SKOV3/DDP細胞單細胞克隆生成能力的影響

實驗分為空白對照組、β-欖香烯（20、40、80μmol·L-1）劑量組。分別取處于對數生長期的SKOV3/DDP細胞200 個，接種于不同6 孔培養板中，輕輕轉動該培養板使細胞分散均勻。待細胞培養24 h 貼壁后，棄去原有培養基，更換含有相應藥物的培養基，放于培養箱中靜置培養14 天。培養結束后，棄去培養基，無菌PBS 浸泡清洗培養孔2 次，無水甲醇固定細胞10 min，小心吸去甲醇，微晾干后加入瑞士吉姆薩染液進行染色10 min，染色結束，吸去染液，PBS 清洗2 遍后，自然晾干后進行拍照，采用Image J 軟件對細胞克隆數進行計數分析。

2.3 流式細胞術檢測β-欖香烯對SKOV3/DDP細胞凋亡的影響

實驗分為空白對照組、β-欖香烯（20、40、80μmol·L-1）劑量組。取處于對數生長期的SKOV3/DDP 細胞分別接種于不同6 孔細胞培養板中，每孔接種細胞數為5×105個，細胞培養24 h 貼壁后，棄去原有培養基，加入含有藥物的培養基繼續培養48 h。培養結束后，棄去培養基，PBS 清洗3 遍后，采用胰酶消化，收集細胞，PBS 清洗2 遍后，離心收集全部細胞至新的無菌EP 管中，加入500μL 的流式上樣緩沖液，移液器輕輕吹打混勻細胞；每個離心管中加入5μL的Annexin V-FITC，移液槍混合均勻；繼續加入5 μL 的碘化丙啶（propidium iodode，PI），移液槍輕輕吹打使混合均勻。將整個混勻后的體系置于室溫避光環境中充分反應10 min，待反應結束，過200 目篩上機檢測。實驗重復3 次，計算細胞凋亡數。

2.4 CCK-8 檢測β-欖香烯逆轉SKOV3/DDP 細胞對DDP 的耐藥作用

取對數生長期的SKOV3/DDP 細胞，調整細胞濃度為2×105/mL，以每孔200 μL 體積接種于96 孔無菌細胞培養板中。細胞培養24 h 貼壁后，分別加入0、2、4、8、16、32、64 mg·L-1的DDP 于細胞培養板中，除空白對照組之外每孔加入10μmol·L-1的β-欖香烯，每個藥物組設置6 個復孔，繼續培養48 h。藥物作用結束后，每個細胞孔中加入10μL 的CCK-8溶液，輕輕敲擊培養板進行混勻，將培養板繼續置于培養箱中孵育2 h。孵育結束后，取出培養板置于酶標儀450 nm 波長處，檢測每孔的吸光度值A450。

逆轉耐藥指數（resistance index，RI）=藥物單獨作用耐藥細胞IC50/藥物聯合逆轉劑共同作用耐藥細胞IC50。

2.5 Western blot 法檢測β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞耐藥蛋白表達的影響

取處于對數生長期的SKOV3/DDP 細胞接種于6 孔細胞培養板，每孔接種數量為2×105個，培養體系為2 mL，實驗分為4 組：空白對照組、β-欖香烯（20、40、80 μmol·L-1）劑量組，細胞處理和給藥方法同方法“2.3”。待藥物作用48 h 后，棄去培養基，RIPA 裂解液充分裂解細胞，提取細胞總蛋白，經BCA蛋白定量后，調整蛋白濃度，加入上樣緩沖液制備上樣蛋白。制備完畢后，參照蛋白電泳方法進行SDS-PAGE 蛋白電泳。電泳結束后，轉膜1.5 h，脫脂奶粉封閉2 h 后，加入經1000 倍稀釋的ABCB1、LRP、P-gp 蛋白一抗和GAPDH 蛋白一抗，將膜置于4 ℃中孵育過夜。次日，去除一抗洗膜后加入2000倍稀釋的蛋白二抗，室溫繼續孵育1.5 h，TBST 洗膜4 次后，凝膠成像系統進行曝光，采用Image J 軟件對蛋白條帶進行灰度值分析，實驗以目標蛋白與內參GAPDH 蛋白灰度值的比值計算目標蛋白的相對表達量。實驗重復3 次。

2.6 統計學方法

實驗數據采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（）表示，樣本均數間比較采用LSD-t 檢驗，采用Graphpad 5.0 軟件進行繪圖。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞增殖的影響

CCK-8 實驗結果顯示，β-欖香烯20、40、80、160、320 μmol·L-1對SKOV3/DDP 細胞增殖有明顯抑制作用，且與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.01）。然后采用β-欖香烯20、40、80 μmol·L-1劑量研究β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞的直接作用。β-欖香烯10 μmol·L-1并不能直接抑制SKOV3/DDP 細胞增殖，見圖1。

圖1 β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞增殖的影響（，n=6）

3.2 β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞克隆形成的影響

克隆形成實驗結果顯示，β-欖香烯20、40、80 μmol·mL-1組對SKOV3/DDP 細胞克隆形成數明顯減少，且與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，β-欖香烯能夠抑制SKOV3/DDP 細胞的克隆生成。見圖2。

圖2 β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞的克隆生成的影響（，n=6）

3.3 β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞凋亡的影響

流式細胞術實驗結果顯示，β-欖香烯20、40、80 μmol·L-1組對SKOV3/DDP 細胞凋亡明顯增加，且與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.01）。結果表明，β-欖香烯能夠促進SKOV3/DDP 細胞的凋亡。見圖3。

圖3 β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞凋亡的影響（，n=6）

3.4 β-欖香烯逆轉SKOV3/DDP 細胞對DDP 的耐藥作用

CCK-8 實驗結果顯示，隨著DDP 濃度的升高，對SKOV3/DDP 細胞的抑制率逐漸升高。β-欖香烯和DDP 聯合使用組對SKOV3/DDP 細胞的抑制率明顯增高，與DDP 組相比差異具有統計學意義。SKOV3/DDP 細胞對DDP 的IC50為17.54 mg·L-1，在β-欖香烯聯合作用下，SKOV3/DDP 細胞對DDP 的IC50下降為6.78 mg·L-1，β-欖香烯能夠逆轉SKOV3/DDP 細胞對DDP 的耐藥，且逆轉倍數為2.58 倍。見圖4。

3.5 β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞耐藥相關蛋白ABCB1、LRP 和P-gp 的影響

圖4 β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞DDP 耐藥的逆轉作用（，n=6）

為研究β-欖香烯抑制SKOV3/DDP 細胞作用的機制，對SKOV3/DDP 細胞中的多藥耐藥相關蛋白進行研究。Western Blot 實驗結果顯示，ABCB1、LRP、P-gp 在SKOV3/DDP 細胞中明顯高表達，在β-欖香烯20、40、80 μmol·L-1組SKOV3/DDP 細胞中的ABCB1、LRP、P-gp 均明顯降低，且與對照組相比差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結果表明，β-欖香烯對卵巢癌細胞的抑制作用和逆轉耐藥作用，可能與抑制SKOV3/DDP 細胞中的耐藥蛋白的表達水平有關。見圖5。

圖5 β-欖香烯對SKOV3/DDP 細胞ABCB1、LRP 和Pgp 耐藥蛋白表達的抑制作用（，n=6）

4 討論

卵巢癌是一種高致死性的婦科腫瘤，而采用順鉑進行化療是卵巢癌規范化治療的必須環節，能夠大大提高患者的總體生存率和生存期[10]。然而，臨床研究發現，腫瘤細胞對化療藥物的多藥耐藥性是化療失敗的主要原因[11]，因而合理使用化療藥物或聯合使用其他藥物逆轉腫瘤細胞耐藥是當前腫瘤治療的重要課題。卵巢癌能夠表達多種腫瘤耐藥蛋白，這些蛋白能夠通過直接與化合物結合、促進胞吐作用或促進化療藥物外排，從而產生化療藥物耐藥[12]，因此抑制耐藥蛋白的表達，以此為靶點開發合理的聯合藥物有望逆轉腫瘤細胞耐藥，增強化療藥物的療效。

β-欖香烯是中藥姜黃屬溫郁金中的主要活性成分，已經被證實是一種廣譜的抗腫瘤成分[6]，現已研制成欖香烯注射液用于聯合其他藥物對肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤的治療;但是對于其增強化療藥物療效是否與直接殺傷腫瘤細胞和或逆轉腫瘤耐藥作用有關還不得而知。

本研究將DDP 耐藥卵巢癌細胞SKOV3/DDP作為研究對象，采用不同濃度的β-欖香烯進行直接作用，研究β-欖香烯對耐藥的卵巢癌細胞的抑制作用，并采用不具有直接細胞毒作用的劑量聯合順鉑進行給藥處理，研究β-欖香烯逆轉腫瘤細胞耐藥的作用。實驗結果顯示，β-欖香烯（20、40、80 μmol·L-1）各濃度能夠抑制SKOV3/DDP 細胞的增殖、克隆生成并促進細胞凋亡。進一步聯合用藥后，發現在無直接細胞毒性10 μmol·L-1濃度下，β-欖香烯能夠逆轉SKOV3/DDP 細胞對順鉑的耐藥作用，其逆轉耐藥的倍數為2.58 倍。這一結果充分證實，β-欖香烯能夠對耐藥的卵巢癌細胞產生抑制作用，且也能夠逆轉腫瘤細胞耐藥，表明其具有良好的抗腫瘤效應。

長期使用化療藥物后，未被殺死的腫瘤細胞能夠表達耐藥蛋白，這些耐藥蛋白通過將化療藥物轉運出細胞、從而實現腫瘤細胞的多藥耐藥，其中ABCB1、LRP、P-gp 是最主要的耐藥蛋白[13，14]，它們在卵巢癌患者中高表達。本研究通過Western blot實驗結果顯示，在SKOV3/DDP 細胞中，ABCB1、LRP和P-gp 表達水平較高，而β-欖香烯能夠劑量依賴性的抑制這幾種耐藥蛋白的表達，結果表明，β-欖香烯逆轉SKOV3/DDP 細胞多藥耐藥的作用機制可能與抑制耐藥蛋白的表達有關。

綜上所述，本研究結果表明，β-欖香烯可以抑制SKOV3/DDP 細胞的增殖生長、促進細胞凋亡，也能夠逆轉SKOV3/DDP 細胞順鉑耐藥，同時對ABCB1、LRP 和P-gp 多種耐藥蛋白表達具有較強的抑制作用。本研究提示，β-欖香烯能夠通過抑制多種耐藥蛋白的表達發揮抗SKOV3/DDP 細胞和逆轉化療藥物耐藥的作用，其成藥性值得后續深入探討。