復合激活劑對混合菌群降解活性艷藍的促進作用及生物降解機理

王怡琴，謝學輝，鄭秀林，張慶云，從軍灝，劉 娜， 柳建設

(1.東華大學 a. 環境科學與工程學院；b. 國家環境保護紡織工業污染防治工程技術中心，上海 201620；2. 上海污染控制與生態安全研究院， 上海 200092；3. 宿州學院 環境與測繪工程學院，安徽 宿州234000)

印染廢水具有穩定性、生物毒性和難降解性等特點，被公認為難處理的廢水之一[1]。許多染料及其中間產物具有致癌、致畸、致突變性，能夠破壞水生環境的生態平衡，威脅人類的健康[2]。因此，如何高效處理染料廢水成為促進印染行業可持續發展的艱巨任務之一。目前，為減少染料廢水的有機負荷，國際上常用物理法、化學法、生物法處理廢水[3-4]。其中，生物法具有成本低、經濟和環境效益良好等優點而被廣泛應用[5-6]。

目前國內外學者對偶氮染料生物處理的研究較為廣泛，而對蒽醌染料生物處理的研究較少。活性艷藍19(reactive brilliant blue 19，RB19)為典型的蒽醌結構染料，具有抗化學氧化的作用，因此在印染廢水中長期穩定地存在，且被生物降解的效率普遍較低[7]。如：Rybczyriska等[8]的研究中，在加入碳源的情況下，菌株Haematonectria haematococca BwⅢ43和K37對蒽醌染料茜素蘭B第14天脫色率分別僅為59%和57%；Holkar等[9]的研究結果顯示，當葡萄糖質量濃度為6 g/L時，菌株Enterobacter sp. F 對蒽醌染料RB19的脫色率達到最大(但脫色速率實際上僅為0.08 mg/h)。由此可見，蒽醌染料生物處理法的效率還有待提升。

激活劑作為一種可以增加酶活性、提高酶促反應速率的物質，在生物處理法中得到了越來越廣泛的應用[10-11]。由于常規生物法處理效率較低，因此研究添加激活劑以提高印染廢水生物處理效率具有重要意義。例如，金屬鹽、氧化還原介質和共代謝基質的加入能提高微生物的降解脫色能力[12-14]。有研究[15-16]指出氧化還原介體通常作為電子供體或直接增加微生物活性，以提高其脫色率，還有研究者[17]指出染料的脫色率由共代謝基質的有效性和類型決定。目前，研究者更多地關注單一激活劑對菌株脫色降解染料的促進作用，而復合激活劑對混合菌群的促進作用研究甚少，且對添加激活物質以激活功能微生物的研究大多處于宏觀層面。因此，研究復合激活劑在混合菌群生物處理中的作用，并探究其作用的生物學機理顯得尤為重要。本課題組前期研究[18]發現茶葉渣可作為一種激活物質促進混合菌群對RB19的降解，并提取茶葉渣中的主要成分制成一種復合激活劑。本研究通過傅里葉變換紅外光譜(FTIR)及液相色譜質譜聯用儀(LC-MS)對激活劑作用下降解產物進行分析，并通過高通量測序和非標及定量蛋白質組學分析對激活劑作用的生物學機理進行深入研究，在印染廢水生物處理中具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗選用的染料為SIGMA-ALOR-ICH公司生產的蒽醌染料RB19。培養基包含無水硫酸鈉為0.5 g/L，氯化銨為0.2 g/L，磷酸二氫鉀為2.66 g/L，酵母提取物為3 g/L。培養基均在121 °C滅菌20 min后冷卻備用。復合激活劑包含表沒食子兒茶素沒食子酸酯質量濃度為 2.5 g/L，茶氨酸質量濃度為2.5 g/L，抗壞血酸質量濃度為6.5 g/L，H3BO3質量濃度為6.5 g/L，FeCl3質量濃度為4.5 g/L，MgCl2質量濃度為0.05 g/L。

本試驗中使用的兩種混合菌群分別為DDMY1和DDMY2[18]，均為本實驗室長期馴化保存的菌種。其中，菌群DDMY1一直以來只用RB19進行培養馴化，而菌群DDMY2長期使用RB19和質量濃度為3 g/L的茶葉渣共同培養馴化。研究前期發現，混合菌群DDMY2的脫色效果優于DDMY1的脫色效果，由此推測是由茶葉渣的激活作用導致的。

1.2 試驗方法

1.2.1 分光光度法測定脫色率

取2 mL脫色液，在8 000 r/min下離心10 min，取上清液在特定波長(597 nm)處的吸光值，根據波長597 nm處吸光值的變化計算脫色率。

(1)

式中：A0為脫色前597 nm 的吸光度值；At為脫色后597 nm 的吸光度值。

1.2.2 復合激活劑對混合菌群DDMY1、DDMY2脫色RB19的影響

文獻[19]研究發現龍井茶葉渣對RB19的降解有促進作用，但茶葉渣對菌群的促進效果受茶葉渣曬制時間、溫度等外界因素與茶葉購買批次影響，因此希望通過模擬茶葉渣中的關鍵成分研制一種穩定的復合激活劑。選用兩種不同的混合菌群DDMY1、DDMY2進行對比，其中一組試驗組不添加復合激活劑(試驗組DDMY1和DDMY2)，另一組(試驗組DDMY1+A和DDMY2+A)添加激活劑的接種量的體積分數為0.1%。將每個試驗組做3個平行樣，在37 ℃的條件下靜置培養。菌液按體積分數為10%的量接種于100 mL錐形瓶中(含45 mL培養基)，其中每個錐形瓶RB19質量濃度為200 mg/L。分別在培養過程中的0、24、36、48、60、72 h取2 mL脫色液，在8 000 r/min速度下離心10 min，用分光光度法測定脫色率。

1.2.3 液相色譜質譜聯用分析

將均添加復合激活劑的混合菌群DDMY1和DDMY2置于培養基中脫色質量濃度為200 mg/L的RB19，靜置恒溫培養72 h。取100 mL脫色液，8 000 r/min速度下離心10 min并保留上清液，將上清液用蒸餾水稀釋至400 mL置于燒杯中。隨后，每個試驗組取2個1 kD透析袋，分別裝50 mL蒸餾水和甲醇，兩端封口置于燒杯中攪拌透析24 h。透析后將2個透析袋中的液體混合均勻，取2 mL透析液在12 000 r/min速度下離心10 min，并用0.22 μm水相針式濾器將上清液過濾，最后將過濾后的樣品轉移至2 mL色譜進樣瓶中，用Agilent QTOF6520型液相色譜質譜聯用儀對樣品進行分析。

色譜條件為采用Agilent zorbax 300Extend-C18 4.6 mm×150 mm的色譜柱，柱填料粒徑為3.5 μm。二元流動相為A相——含濃度為20 mmol/L醋酸銨的超純水，B相——含濃度為20 mmol/L醋酸銨的甲醇。質譜條件為0.276 MPa噴霧器壓力，干燥氣為350 ℃氮氣，流速為9 L/min。

1.2.4 高通量測序

根據文獻[20]利用高通量測序對8種不同樣品的菌群結構進行分析。試驗中所測得的16 SrDNA基因序列已保存在NCBI GenBank中，并獲得序列登錄號為SRP193910。

1.2.5 蛋白質組學分析

非標記定量技術用于比較樣品不經過任何標記，直接酶解后經過質譜分析產生數據。通過Thermo Xcalibur 4.0軟件對譜圖進行歸一化后，比較對應質譜峰的強度、峰面積等一系列因素，以此來確定蛋白質在4組樣本中的相對表達量變化。

2 結果與討論

2.1 復合激活劑對混合菌群DDMY1、DDMY2脫色RB19的影響

復合激活劑對混合菌DDMY1、DDMY2脫色RB19的影響，如圖1所示。

圖1 復合激活劑對DDMY1、DDMY2脫色RB19效果影響Fig.1 Effect of complex activator on decolorization of RB19 by bacterial consortia DDMY1 and DDMY2

由圖1可知，復合激活劑的加入能顯著提高菌群DDMY1對 RB19的脫色率。試驗組DDMY1+A在72 h的脫色率為77.81%，比樣品DDMY1(70.57%)高7.24%。而在相同時間內，DDMY2+A的脫色率為85.16%，僅比DDMY2(83.39%)高1.77%。與DDMY1相比，復合激活劑的加入并不能顯著促進DDMY2對RB19的降解，但DDMY2、DDMY2+A的脫色率整體高于DDMY1、DDMY1+A。這是由于復合激活劑的配方是模擬茶葉渣中的主要成分制成的，所以復合激活劑的加入對于經過茶葉渣馴化的菌群(DDMY2)影響較小；此外，復合激活劑加入對未經過茶葉渣馴化的普通菌種(DDMY1)脫色降解RB19有很大的促進作用。相較于文獻[8]的研究，額外加入干酪素水解物菌株Haematonectria haematococca BwⅢ43和K37對蒽醌染料茜素蘭B脫色率達到80%～90%需要7 d。而本試驗中，復合激活劑的加入能夠使菌群在短時間內對RB19有較好的脫色降解效果。由此表明，這類復合激活劑在實際印染廢水處理中具有重要意義。

2.2 復合激活劑誘導下混合菌群對RB19的降解產物分析

使用LC-MS分析了激活劑誘導混合菌群DDMY1脫色RB19的降解產物。將初始未降解的RB19作為對照組，在正離子模式下觀察到m∶z為625的母離子峰。經過72 h的脫色降解，母離子峰逐漸消失，且激活劑誘導下混合菌群DDMY1對RB19的降解產物在正離子模式下發現3個新的離子峰，m∶z分別為197、167、181，對應的降解產物分別為3，6-二氨基苯二甲酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸鈉。激活劑誘導下混合菌群DDMY2對RB19的降解產物在正離子模式下也發現3個新的離子峰，m∶z分別為197、167、158，對應的降解產物分別為3，6-二氨基苯二甲酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸。根據LC-MS測定的降解產物并結合文獻[21-24]中的試驗結果，本試驗推測了兩種不同混合菌群降解RB19的分子轉化途徑，如圖2和3所示。RB19在降解的過程中蒽醌環結構被打開，降解為小分子的芳香族化合物。因此，在激活劑作用下兩種混合菌群能夠實現染料的脫色，并將大分子有機物轉變為小分子有機物，無法完全礦化，且降解產物仍有一定毒性[25-26]，需后續進一步處理。但這類方法仍不失為一種高效且成本低廉的染料預處理方法。

圖2 激活劑誘導下混合菌群DDMY1降解RB19分子轉化途徑Fig.2 Molecular transformation pathway of RB19 degraded by bacterial consortium DDMY1 induced by activator

圖3 激活劑誘導下混合菌群DDMY2降解RB19分子轉化途徑Fig.3 Molecular transformation pathway of RB19 degraded by bacterial consortium DDMY2 induced by activator

2.3 復合激活劑對混合菌群結構的影響

為進一步研究復合激活劑對混合菌群DDMY1、DDMY2群落結構的影響，使用RDP(ribosomal database project)分類器將序列標簽分配到不同的分類水平，如圖4所示。

由圖4(a)可知，在門水平上8個樣品具有高度的相似性，但菌種豐度不同。變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為3種主要的菌門，占每個樣品中所有菌種的99%以上。其中，變形菌門在所有樣品中占比最高，這說明變形菌門為RB19脫色系統中主要的菌門。文獻[27]研究發現變形菌門在其他廢水處理系統中占主導地位。文獻[28-29]在染料廢水處理中發現，擬桿菌門的菌種可以適應復雜的環境并分泌各種氧化還原酶。與樣品DDMY1-初始、DDMY1馴化6個月相比，樣品DDMY1+A、DDMY1+A 馴化6個月中變形菌門的含量分別多了6.00%和14.02%，而擬桿菌門的含量分別少了6.18%和16.21%。此外，樣品DDMY2-初始、DDMY2馴化6個月、DDMY2+A 和 DDMY2+A馴化6個月中變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門比例具有更高的相似性。上述結果說明，復合激活劑的添加可以顯著改變普通菌群(如本試驗中的試驗組DDMY1)的菌群結構，且能夠增加在RB19脫色降解過程中發揮重要作用的變形菌門含量。同時，添加復合激活劑至試驗組DDMY2中并沒有顯著改變其菌群結構，說明混合菌群DDMY2具有更加穩定的菌群結構，且不易受外界因素影響。由圖4(b)可知，在綱水平上樣品DDMY1-初始和DDMY1馴化6個月中γ-變形菌綱和β-變形菌綱的含量顯著增加，而黃桿菌綱含量顯著下降，其中γ-變形菌綱在所有樣品中均為最主要的綱。γ-變形菌綱為革蘭氏陰性菌，被發現廣泛存在于染料廢水處理系統中[30-31]。由圖4還可以發現，樣品DDMY2-初始、DDMY2馴化6個月、DDMY2+A 和DDMY2+A 馴化6個月中均存在擬桿菌綱，而在試驗組DDMY1-初始中未檢測到擬桿菌綱。由此可以推測，加入復合激活劑能夠富集γ-變形菌綱和擬桿菌綱這類脫色RB19的優勢菌綱。

(a) 門水平

2.4 復合激活劑誘導混合菌群降解RB19的蛋白質組學分析

2.4.1 肽段與蛋白質鑒定、定量結果評估

本試驗采用串聯質譜儀thermo scientific q-exactive進行檢測。圖5(a)為鑒定蛋白信息統計圖。在4個樣品中共檢測到480 207個二級譜圖，匹配了160 705個肽段，鑒定了16 754個肽段序列和5 355個蛋白質組。圖5(b)為鑒定肽段序列長度分布圖，大部分肽段所含氨基酸的個數為9～21個，其中含有11、12個氨基酸的肽段最多。圖5(c)為肽段數量分布圖，顯示了鑒定到的蛋白所含肽段的數量分布情況。由圖5(c)可知，蛋白質數量隨著肽段數量的增加而減少，73%左右的蛋白質最多含有4個肽段。圖5(d)顯示蛋白質分子量，其中蛋白質分子量多數為11～20 kDa，約占蛋白質總量的22%，且80%左右的蛋白質分子量處于11～60 kDa。

(a) 蛋白信息統計圖

2.4.2 激活劑誘導的蛋白差異表達

表1為分組樣品DDMY1vs DDMY1+A、DDMY2 vs DDMY2+A的差異蛋白數量，顯著差異表達蛋白的篩選標準為差異顯著性P<0.05和兩樣品間表達量的比值FC<0.83或FC>1.20。由表1可知，激活劑的加入會顯著影響兩種混合菌群功能蛋白的差異表達，且與DDMY2對比 DDMY2+A比較，DDMY1對比 DDMY1+A差異蛋白的數量有所增加，說明激活劑對混合菌群DDMY1功能蛋白表達的促進作用強于其對混合菌群DDMY2。

表1 分組樣品中不同表達蛋白的數量(P<0.05 & FC<0.83或FC>1.20)Table 1 Number of differently expressed proteins in different samples (P<0.05 & FC<0.83 or FC>1.20)

2.4.3 激活劑誘導差異表達蛋白的功能分析

利用基因本體論對不同組樣品進行注釋分析，其中，BP(biological process)為生物過程，CC(cellular component)為細胞組分，MF(molecular function)為分子功能。圖6對不同分組對比的上調差異蛋白進行了功能注釋分析。相同的蛋白質可能參與不同的生物過程，成為不同的細胞組分以及具有不同的分子功能。

圖6(a)顯示了DDMY1+A相較于DDMY1，前者參與生物過程的上調蛋白為2 521個，其中約有70%的上調蛋白參與了細胞過程和代謝過程。在細胞組分分類中上調蛋白的數量為1 983個，其中，膜類別和細胞部分類別蛋白含量較多，其次為膜部分類別和蛋白質復合物類別。分子功能中上調蛋白數量為2 674個，其中多數具有催化活性和結合分子功能，占上調蛋白的78%，其次為結構分子活性和轉運功能。

圖6(b)顯示了相較于DDMY2，DDMY2+A參與生物過程的上調蛋白數量為2 227個，約有68%的上調蛋白參與了細胞過程和代謝過程。在細胞組分分類中上調蛋白數量為1 809個，其中，細胞部分類別和膜類別蛋白含量較多，其次為膜部分類別和蛋白質復合物類別。分子功能中上調蛋白的數量為1 950個，約有77%具有催化活性和結合分子功能，其次為結構分子活性和轉運功能。

圖6 在激活劑誘導下不同混合菌群上調差異蛋白的基因本體論分析Fig.6 Gene ontology analysis of up-regulated differential proteins in different bacterial consortia induced by activators

2.4.4 差異表達蛋白KEGG通路分析

在生物體內，基因產物并不是孤立存在作用的，不同基因產物之間通過有序地相互協調來行使具體的生物學功能。為從系統水平了解差異蛋白的生物學功能，對鑒定的差異蛋白KEGG通路進行注釋。圖7顯示了兩項分組樣品DDMY1 vs DDMY1+A、DDMY2 vs DDMY2+A差異蛋白前30條注釋結果。在激活劑誘導下兩種不同混合菌群DDMY1、DDMY2差異蛋白參與的KEGG通路最主要為代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、抗生素的生物合成、碳代謝。分組樣品DDMY1 對比DDMY1+A與分組樣品DDMY2對比DDMY2+A的KEGG通路基本相同，說明激活劑對兩種不同混合菌群差異蛋白表達的作用類似。除了上述的通路外，苯甲酸的降解途徑也得到了豐富，且苯甲酸酯降解的代謝產物被認為可用于脂肪酸、氨基酸代謝等富集途徑[33]。上述LC-MS試驗中已檢測到降解中間體及產物中存在苯甲酸類物質。因此，推測RB19被先降解為苯甲酸酯，隨后進一步進行糖酵解、檸檬酸循環等[34]。與分組樣品DDMY2對比DDMY2+A相比，分組樣品DDMY1對比DDMY1+A中前30組代謝途徑中活躍的差異蛋白均更加豐富，說明激活劑對混合菌群DDMY1的影響大于其對混合菌群DDMY2的影響的促進作用。

圖7 在激活劑誘導下不同混合菌群差異蛋白的KEGG通路Fig.7 KEGG pathway of differential proteins of different bacterial consortia induced by activator

3 結 論

(1) 本文以混合菌群DDMY1、DDMY2為對象，研究了激活劑對兩種混合菌群的促進作用，結果表明復合激活劑的加入對DDMY1的促進作用優于其對DDMY2的作用。

(2) 由LC-MS測定結果可知，在激活劑誘導下混合菌群DDMY1對RB19的降解產物主要為3，6-二氨基苯二甲酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸鈉，而在激活劑誘導下混合菌群DDMY2對RB19的降解產物分別為3，6-二氨基苯二甲酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸。

(3) 高通量測序結果表明激活劑可簡化群落結構，且能夠富集腸桿菌屬，這可能是增強混合菌群對RB19脫色降解的原因。從生物過程角度分析，兩組分組樣品DDMY1 vs DDMY1+A、DDMY2 vs DDMY2+A的上調蛋白均大部分參與了細胞過程和代謝過程。在細胞組分分類中，激活劑對菌群DDMY1在差異蛋白表達上影響更大。分組樣品大多數的上調蛋白均與催化活性、結合分子功能相關。在激活劑誘導下兩種不同菌群DDMY1、DDMY2差異蛋白參與的KEGG通路前4條為代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、抗生素的生物合成、碳代謝，同時，苯甲酸的降解途徑也得到了證實。