不同相對分子質量透明質酸對還原型谷胱甘肽透皮吸收的影響

唐澤嚴，郭學平，溫喜明，王玉玲*，呂慧俠**

（1中國藥科大學藥學院藥劑系，南京211198；2山東華熙海御生物醫藥有限公司，濟南250010）

透明質酸（hyaluronic acid，HA）又稱玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的雙糖單位的糖胺聚糖。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之間由β-1，3-配糖鍵相連，雙糖單位之間則由β-1，4-配糖鍵相連。HA的相對分子質量可由5 000～2×107Da之多，因其獨特的保濕（可以吸收其質量1 000倍的水分）、潤滑和促進細胞修復等功能［1-2］，HA已經被廣泛應用于醫藥和化妝品領域，發揮其美容保健、關節腔潤滑以及組織再生等功能［3］。此外還有報道表明，HA可以促進某些藥物的經皮吸收，Son等［4］用低相對分子質量透明質酸結合十二烷胺包裹吲哚菁綠制備成水凝膠后，增強了離體豬皮角質層、活性表皮層和真皮層中的滯留。Yue等［5］用改良的透明質酸制備負載布比卡因的納米脂質體，體外皮膚滲透實驗表明，72 h內相比于對照組經皮透過量提高了2.5倍。

還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成。GSH存在于機體的每一個細胞中，半胱氨酸上的巰基能與某些藥物和毒素（如自由基、芥子氣和各種鉛汞砷等重金屬）等結合，發揮解毒的作用；GSH還能幫助人體保持機體正常的免疫系統功能；并且由于其抗氧化能力，還被應用于化妝品中發揮美白祛斑抗過敏的功效［6-8］。但由于GSH水溶性好（50 mg/mL），油水分配系數低（lg P=-0.87），難以透過皮膚角質層的特點，其在經皮給藥領域研究較少。

與透皮給藥系統（發揮全身作用的藥物制劑）不同的是，治療局部皮膚疾病的藥物，如治療皮膚癬的抗真菌類藥物，希望其可以更多的進入角質層，并儲留于角質層中發揮抗真菌的作用，并且藥物盡可能少的進入真皮，被毛細血管吸收進入全身血液循環，從而可以盡可能少的產生全身副作用；對于作用于皮膚不同層次的化妝品中功效成分，如保濕劑則可能希望藥物在角質層中儲留發揮保濕作用，美白成分則作用于基底層中的黑色素細胞，營養和抗皺類成分則盡可能的停留于真皮中。目前大多關于經皮給藥的研究更多的是關注難溶性的藥物或功效成分，如何采用新制劑或新劑型［9-14］，促進其的透皮吸收，但對于藥物在皮膚不同層次中的儲留情況，則少有報道。而在外用制劑和化妝品中，又常常會加入海藻糖、透明質酸等多糖或纖維素衍生物，作為增稠劑或保濕劑使用。這些成分的加入，對于水溶性藥物，兩者之間是否存在相互作用，是否會改變這些水溶性藥物的透皮吸收行為，值得研究。本研究以水溶性好、難透皮吸收的GSH為模型，考察不同相對分子質量的HA對GSH在離體鼠皮的皮膚滲透與儲留的影響，并采用分子對接AutoDock和傅里葉衰減全反射紅外光譜、HE切片染色等方法探討HA與GSH的相互作用以及HA對皮膚結構的影響，從而為HA等水溶性多糖材料在外用制劑或化妝品中對藥物的經皮滲透和儲留的影響提供一定的借鑒。

1材料

1.1 藥品與試劑

還原型谷胱甘肽（阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：K1728038，純度：98%），透明質酸7K、42K、360K、920K（相對分子質量分別為7×103、4.2×104、3.6×105、9.2×105華熙生物科技股份有限公司，批號：1810071），透明質酸90K（相對分子質量分別為9×104大連美倫生物，批號：M0504A），5，5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸（阿拉丁，批號E1922062），磷酸二氫鉀（江蘇永華化學科技，批號：20190103），氯化鈉（廣東西隴科學，批號：190305-1），實驗用水為超純水，其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；LOGAN干加熱透皮擴散儀DHC-6TD（美國祿亙儀器公司）；RYJ-12B型藥物透皮擴散試驗儀（上海黃海藥檢儀器公司）；高通量組織研磨儀（南京貝蒂實驗儀器公司）；雷磁PHS-3CpH計（上海儀電科學儀器公司）；D3024R高速離心機（北京大龍實驗儀器公司）；Vortex 2圓周震蕩器（德國IKA公司）；Vertex 70傅里葉變換全反射光譜儀（德國布魯克公司）。

1.3動物

SD大鼠［許可證號碼：SCXK（滬）：2018-0006］由南京青龍山動物繁育場提供，所有動物實驗操作均符合中國藥科大學倫理委員會標準；實驗動物從業人員上崗證號：220193856。

2方 法

2.1 GSH含量測定方法學的建立

2.1.1 GSH柱前衍生化 采用5，5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸（DTNB）衍生化試劑與GSH進行反應，再通過HPLC測定了透皮吸收液與皮膚組織中的GSH［15］。樣品中GSH的巰基與DNTB反應生成衍生化產物，在偏酸性流動相中，在紫外區有吸收，利用紫外檢測器能夠靈敏的檢出良好的色譜峰，借此可以鑒定GSH的含量［16］。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：島津Shim-pack GISC18色譜柱。流動相為二元梯度流動相體系A：0.025%磷酸二氫鉀（pH 3.8）；B：甲醇，梯度洗脫程序：12%B（0～3 min）→8%B（3.01～4.5 min）→40%B（8.5～15 min）→12%B（15.01～20 min）；流速1 mL/min（0～3 min）→0.6 mL/min（3.01～4.5 min）→0.8 mL/min（8.5 min）→1 mL/min（15～20 min）。進樣量20μL，柱溫為39℃，檢測波長：330 nm。

2.1.3 標準曲線的建立 精密稱取GSH 10.13 mg，置于10 mL量瓶中，空白皮膚接受液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成儲備液。分別精密量取0.1、0.5、1、2、5 mL儲備液，置于10 mL量瓶中，用空白皮膚接受液定容，得到1.01、5.07、10.13、20.26、50.65μg/mL的對照品溶液。精密量取上述對照品溶液1 mL，加入100μg/mL DTNB溶液1 mL并渦旋3 min，取反應液20μL分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以GSH質量濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸。取2.2 cm2皮膚剪碎加入20.26、50.65、202.6、506.5、1 013.00μg/mL GSH標準溶液1 mL，液氮冷凍后勻漿，12 000 r/min高速冷凍離心12 min，取勻漿液500μL，加入甲醇沉淀劑500μL，于12 000 r/min高速冷凍離心12 min。再取上清液500μL最后加入1 mg/mL DTNB衍生化試劑0.5 mL渦旋反應3 min，取反應液20μL分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以GSH質量濃度（μg/mL）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸。

2.1.4 溶液穩定性 取質量濃度為50.65μg/mL的GSH對照品儲備液1 mL，與TNB 1 mL反應后在1、2、4、6、12、24 h分別進樣20μL，記錄色譜峰面積，與0 h峰面積進行比較，計算RSD。

2.1.5 進樣精密度 取質量濃度為50.65μg/mL的GSH對照品儲備液，與1 mL DTNB反應后，連續6次注入色譜儀（n=6），記錄峰面積，計算RSD。

2.1.6 回收率 取數份2.2 cm2空白皮膚剪碎，分別加入高、中、低3種質量濃度（1 013.00、506.50、200.65μg/mL）對照品溶液，每個質量濃度配備3份（n=3）。勻漿操作參考“2.1.3”項下，測定藥物含量，計算提取回收率。

2.2 不同相對分子質量HA對GSH體外透皮吸收與皮膚不同層次儲留性能的影響

2.2.1 GSH在離體皮膚中的透皮吸收 將處理好的鼠皮從冰箱中取出，用生理鹽水泡至室溫，切割并固定在擴散池上。真皮一側與接收液接觸，角質層面向供給池。磁力攪拌速度為400 r/min，水浴溫度為（32±0.5）℃。接收池加入生理鹽水溶液6.5 mL，供給池分別加入含有1%的7K、42K、90K、360K、920K相對分子質量的HA與GSH（0.125 mmol/mL）的溶液2 mL，分別于1、2、4、6、8、10、12 h時從接收池中取出接受液1 mL，同時向接受池中補加等量的接收液。取出1 mL接收液后加入DTNB溶液1 mL反應渦旋反應3 min，進樣前0.45μm微孔濾膜過濾。

2.2.2 不同層次離體皮膚中GSH儲留量 與“2.2.1”項下相同方法處理皮膚和給予相同樣品后，分別于1、4、8、12 h取出皮膚，用生理鹽水清洗皮膚3次后用膠帶粘貼法［17-18］粘貼表皮20次，將角質層部分粘下，并將膠帶置于20 mL生理鹽水中浸泡提取12 h，取提取液2 mL高速離心，再取1 mL上清液與1 mL 1 mg/mL DTNB衍生化試劑渦旋反應3 min，進樣前0.45μm微孔濾膜過濾。除角質層外的活性真皮部分剪碎后加入生理鹽水溶液1 mL，液氮冷凍后勻漿，12 000 r/min高速冷凍離心12 min，取勻漿液500μL，加入500μL甲醇溶液，于12 000 r/min高速冷凍離心12 min。再取上清液500μL最后加入1 mg/mL的DTNB衍生化試劑0.5 mL渦旋反應3 min，進樣前0.45μm微孔濾膜過濾。

2.3 HA影響藥物經皮吸收的機制研究

2.3.1 分子對接 利用分子對接軟件AutoDock進一步研究HA單體與GSH的相互作用，從而進一步解釋HA對GSH透皮吸收行為產生影響的原因。使用ChemDraw畫出HA和GSH結構式，并進行MM2運算使其能量優化。使用AutoDockTools對GSH與HA進行分子模擬，AutoDock的拉馬克遺傳算法（Lamarckian genetic algorithm，LGA），可以識別分子間的相互作用力，從而計算出可能的構象。進一步判斷兩分子間的相互作用。

2.3.2 全反射傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）取0.25 cm2皮膚置于0.2%胰酶磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）的24孔板中，真皮面與底部接觸，于37℃經8 h孵育，直到真皮部分被移除。用棉簽將角質層從糊狀物中分離，將分離的角質層用水清洗，在真空干燥器中干燥24 h干燥后即可得分離的角質層［19］。分別取大小適宜的干燥角質層片，分別置于6孔板內。對照組（生理鹽水溶液），處方組（1%不同相對分子質量的HA生理鹽水溶液）。分別取干燥角質層片至于3 mL各組對應的溶液中，室溫條件下孵育12 h后，用蒸餾水清洗掉角質層片上的殘留溶劑，放置于真空干燥（硅膠）干燥12 h，干燥后的角質層片采用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）進行掃描測定，儀器參數設置為：分辨率2 cm-1，掃描次數100，掃描范圍為650～4 000 cm-1［20］。

2.3.3 HE染色法研究HA對皮膚微觀結構的影響 分別設置空白組，1%的不同相對分子質量的生理鹽水HA溶液組。雄性大鼠烏拉坦麻醉后小心剃去腹部毛使皮膚暴露，大鼠腹部分別給予上述6組樣品100μL，8 h后處死大鼠，剝取經上述樣品涂布的皮膚，除去皮下脂肪，用生理鹽水清洗后置于4%多聚甲醛中固化24 h。依次將樣品脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烘干、脫蠟后，HE染色脫水透明封片。

3結果

3.1 GSH方法學

3.1.1 GSH標準曲線 實驗結果表明，GSH在皮膚接收液中線性關系良好，其線性回歸方程為A=16 598c+5 257.4（r2=0.999 5）。在皮膚真皮勻漿液中GSH線性關系良好，其線性回歸方程為A=5 360c-56 575（r2=0.999 5）。

3.1.2 穩定性 結果表明24 h內不同時間點的峰面積RSD為2.63%（n=6），表明GSH在透皮接受液生理鹽水中穩定性良好。

3.1.3 精密度 結果表明日內精密度峰面積RSD分別為2.00%和0.95%（n=6），說明該儀器進樣精密度良好。

3.1.4 回收率 結果表明皮膚勻漿高中低濃度GSH回收率分別為91.95%、95.85%、100.23%，RSD分別為0.41%、1.03%、1.27%（n=3），方法符合要求。

3.1.5 GSH在離體皮膚中的透皮吸收量 如圖1-A所示，GSH組12 h藥物累計透過量為125.81μg/cm2，而添加HA后的各組，GSH的透皮吸收均有所下降，7K、42K、90K、360K、920K組分別為92.03±6.64、61.12±4.12、35.21±3.19、29.93±7.58、16.04±3.63μg/cm2，統計學分析表明，游離GSH組與加了低相對分子質量7 000的HA組相比沒有顯著差異，與其他組相比則均有顯著性差異（P＜0.05）。表明高相對分子質量HA可以阻礙GSH的透皮吸收，但7 000以下的低相對分子質量HA則沒有影響。HA相對分子質量越大，GSH的經皮透過量越少，這可能與相對分子質量增加，HA溶液的黏度增加，阻礙了藥物的經皮滲透有關［21］。

3.1.6 不同層次離體皮膚中GSH儲留量 不同GSH與HA組處理大鼠皮12 h后，皮膚角質層與真皮層藥物滯留結果如圖1所示。從圖1-B，1-C可以看出，相對分子質量為7 000，42 000，90 000的HA在角質層中對GSH均有顯著性促進儲留的作用，儲留的GSH的量分別為對照組1.76、1.66和2.24倍，說明低相對分子質量HA可能借助其對皮膚的水合作用，也可能與GSH相互作用增強了其在角質層的滯留。在大鼠活性表皮和真皮層中GSH的儲留量分別為對照組的1.52、0.92和0.64倍，相對分子質量最小的HA（7K）在活性表皮和真皮層的滯留量，與對照組和中高相對分子質量HA（90K、360K、920K）組相比有顯著性差異，表明低相對分子質量HA能在一定程度上促進藥物進入真皮深處。但是高相對分子質量HA（360K，920K）在角質與真皮12 h中的滯留分別僅為對照組的0.36，0.28；0.36，0.21倍，說明高相對分子質量HA可能由于其黏度過大，使GSH束縛在其空間結構中，限制了藥物的滲透。總體來說（圖1-D），高相對分子質量HA不利于GSH的滲透和滯留，低相對分子質量HA能夠幫助其更好的進入角質以及更深處。

Figure 1 In vitro transdermal profiles of glutathione(GSH)permeated through rat skin(A)and retention amount of GSH in the stratum corneum of rat skin(B),epidermis and dermis of rat skin(C)and in the wholerat skin（D）(xˉ±s,n=3)HA:Hyaluronic acid*P＜0.05 vs GSH control group

3.2 ATR-FTIR對角質層的影響

表1為不同相對分子質量HA對大鼠皮膚角質層脂質以及角蛋白振動峰的位移變化，由表中數據可以看出，生理鹽水對照組的脂質吸收峰為2 918.1和2 850.6 cm-1。而與對照組脂質吸收峰相比，高相對分子質量HA（360K，920K）對于脂質的影響較小，中相對分子質量與低相對分子質量HA（7K，42K，90K）均向長波方向移動，其中1%90K HA脂質峰位分別增加了4.2，2.2 cm-1，表明HA對脂質有一定的相互作用。對照組角蛋白NH-C=OⅠ、Ⅱ峰位分別為1 649.1，1 542.9 cm-1，與對照組相比，不同相對分子質量透HA的峰位均向短波方向移動，其中1%7K HA與1%42K HA最為顯著，角蛋白峰位分別減少了5.4，3.3 cm-1與5.1，1.0 cm-1。這說明低相對分子質量HA能夠使皮膚角質層中的角蛋白α-螺旋結構減少，轉變為β-片層與無規則卷曲結構［22］，因此HA可以使得角蛋白堆積變得疏松，角質層對透皮藥物的阻礙減小來達到促滲目的。

3.3 HE染色

HE染色結果見圖2。8 h后生理鹽水組的皮膚結構完整。被覆鱗狀上皮完整，角質層完好無損，呈帶狀均勻分布在活性表皮之上，無角質層脫落或游離，膠原纖維束緊密排列；而不同相對分子質量HA組皮膚角化層結構不完整，疏松，脫離增厚現象較明顯，一些區域外層的角質呈帶狀游離分布，間隙變大，并且HA相對分子質量越低，其水合作用越強，角質層越疏松，但除角質層外對其他皮膚結構則無明顯影響。表明了HA可以增加皮膚角質層的水合作用，從而增大了角質層的細胞間隙。研究表明，低相對分子質量的HA可以通過受體介導（CD44）等作用進入皮膚中，Zhang等［23］證實了炎癥性銀屑病皮膚中過度表達的CD44蛋白可作為透明質酸載體的潛在靶點，以增加藥物在皮膚中的蓄積。當HA進入角質層后，因角質層含水量比真皮層低（角質層含水量一般為15%～20%，而真皮層則含70%），因此其增加角質層的水合作用比較明顯。而相對分子質量越高，進入皮膚能力越差，因此顯示出從圖2-B到圖2-F的差異性。

Table1 Effect of HA with different relativemolecular weight on theshift of lipid and keratin vibration peak in rat skin stratumcorneum

3.4 分子對接

由圖3可知，通過200次的構象搜索，獲得了HA與GSH相互作用的不同能量構象。將接近的構象進行成簇分析，通過搜索對接結果可以得出：GSH與HA包合物最優構象簇A1為63次，第二優勢構想A2為34次，且最優構象的結合能為-2.90 kJ/mol。結合模式分析顯示，GSH可以與HA結合形成了5個氫鍵，氫鍵的結合代表兩者具有較強的相互作用力，這可能也是HA阻礙GSH經皮透過的原因之一。

Figure 3 Molecular docking of the lowest docking energy conformation of HA with GSH(A)and energy distribution diagram of molecular docking results(B)

4討論

HA廣泛應用于外用制劑中，有報道認為其具有一定的藥物經皮促滲透作用。Nashchekina等［24］研究表明，低相對分子質量HA能夠有效增強在皮層上的遞送。Kim等［25］制備了透明質酸/β-葡聚糖納米凝膠，結果顯示該制劑能夠穿透角質層并沉積在真皮中。但這些報道中大部分研究的模型藥物均為難溶性藥物，而水溶性藥物研究較少。因此本研究以水溶性的GSH為模型進行考察，并探究不同相對分子質量HA對GSH是否具有經皮促滲或皮膚儲留作用，以及透明質酸在其中的作用機制。

根據傅里葉全反射紅外光譜結果，低相對分子質量HA作用于角質層后，角質層角蛋白酰胺峰向低峰位移動，對脂質峰位沒有顯著影響。高相對分子質量HA作用于角質層后角質層角蛋白酰胺峰無顯著性影響，脂質峰位向高峰位移動。說明HA對皮膚的作用機制主要是其結合于皮膚后會使皮膚角質層結構發生紊亂，低分子HA主要影響角蛋白，使其從α-螺旋結構轉變為β-片層結構，中高相對分子質量HA主要擾亂角質層脂質。

GSH與HA的相互作用，通過分子對接研究得到了證實，兩者能形成氫鍵，表明GSH能在制劑中與HA相互作用，使其不易于快速進入皮膚。而當HA發揮保濕作用，增加了皮膚的水合度后，藥物與HA的結合則可以發揮儲庫作用，緩慢進入皮膚角質層和真皮層中。

GSH為極性化合物，水溶性好而較難透過皮膚角質層。加入HA后，由于HA與GSH強烈的相互作用，阻礙了其快速進入皮膚，但低相對分子質量的HA則相對于高相對分子質量的HA表現出更好的角質層和真皮層的藥物儲留作用［26］。已有研究表明，低相對分子質量（特別是幾千相對分子質量）HA比高相對分子質量HA更容易穿透皮膚［27］。因此，低相對分子質量HA進入皮膚的量比高相對分子質量HA更多，與角質層蛋白和脂質作用更明顯，從而表現出了較好的藥物透皮促進或儲留能力。

本研究證實了不同相對分子質量的HA對于GSH透皮吸收和皮膚儲留有顯著的影響，并且不同的相對分子質量影響不同。這種阻礙藥物透皮吸收、但促進皮膚儲留的作用對于皮科制劑和化妝品中的有效成分（如抗皮膚真菌類藥物、防曬、保濕和美白的功效成分等）進行配方篩選和研究，發揮其在不同皮膚層次的藥物療效有一定的指導意義。