注射用腦蛋白水解物（Ⅱ）促進神經細胞軸突再生及其相關機制

魏大廈，管 昕，張盛濱，余 芳，王存芳，周 余，龐 濤*

（1中國藥科大學藥物科學研究院新藥篩選中心，南京210009；2廣東隆賦藥業股份有限公司，中山528451）

神經元和神經元之間的軸突連接對于維持神經系統的功能十分重要，在中樞神經系統中，多發性硬化［1］、腦卒中［2］、肌萎縮性側索硬化癥［3］和帕金森病［4］等多種神經系統疾病的病理進程中均出現神經元軸突損傷，破壞神經元的功能。神經營養因子的缺乏、膠質疤痕的形成以及微環境中具有抑制作用的分子都會導致軸突再生障礙［5］，但當藥物可以促進軸突再生時即可恢復神經元功能，改善損傷后的中樞神經元［6］。因此，尋找促進軸突再生的藥物可以成為治療損傷神經元的新策略。

注射用腦蛋白水解物（Ⅱ）［cerebroprotein hydrolysate for injection（Ⅱ），CBL］是豬腦蛋白經酶水解而產生的富含多種氨基酸和小分子生物活性多肽的混合物，作用于神經系統，促進神經元的存活，具有神經營養和神經保護的作用［7］。Plosker等［8］研究發現，對SD大鼠靜脈注射125I標記的腦蛋白水解物0.79 mg，35 min后，檢測到每克腦組織中腦蛋白水解物的平均含量為170～237 ng。據文獻報道［9-10］，已在臨床上使用CBL治療缺血性腦血管病，可顯著改善神經功能，促進神經元的分化，保護神經元免受缺血和神經毒素的影響。但是，尚不清楚CBL改善神經功能的作用是否與軸突再生有關，缺乏對CBL的作用機制的探究。

本文研究了CBL對神經細胞軸突再生的作用，闡述了CBL的作用機制，發現CBL可能是通過激活TrkB信號通路發揮作用，研究結果為進一步提高CBL藥物臨床應用提供理論指導。

1材料

1.1 藥品與試劑

注射用腦蛋白水解物（Ⅱ）（CBL，國藥準字H20051230，規格：30.5 mg，無菌凍干粉，內含約16種游離氨基酸和不同長度的多肽，以及適宜輔料，廣東隆賦藥業股份有限公司）；MEM培養基、DMEM/F12培養基、青鏈霉素（美國Gibco公司）；Neurobasal培養基、B27添加劑、胰酶、Hoechst 33342（美國Invitrogen公司）；DNA酶、多聚賴氨酸（美國Sigma公司）；胎牛血清（美國Clark公司）；Hank's平衡鹽緩沖溶液（美國賽默飛世爾公司）；RIPA細胞裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司）；牛血清白蛋白（BSA，南京生興生物科技有限公司）；上樣緩沖液（美國Bio-Rad公司）；Alexa Fluor 633羊抗鼠IgG（H+L）抗體、p-TrkB（Tyr706）抗體（美國Affinity Biosciences公司）；β-actin抗體（武漢愛博泰克公司）；TUBB3抗體、TrkB抗體（美國Protein?tech公司）；山羊血清（北京索萊寶公司）；Triton-100（上海生工生物工程有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器

FV3000型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）；Operetta Phenix高內涵熒光成像系統（美國PerkinElmer公司）；BT25S電子分析天平（德國Sar?torius公司）；BB15型CO2細胞培養箱（美國Thermo公司）；垂直凝膠電泳儀、Gel DOCXR凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；冷凍離心機（美國Thermo公司）。

1.3 細胞株和動物

Neuro-2a細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。懷孕兩周的SPF級C57BL/6孕鼠，體重（30±2）g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司（合格證號：SYXK（蘇）2016-0011）。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2方法

2.1 化合物的配制

如先前報道所述［11-12］，CBL的蛋白質含量根據凱氏定氮法（GB 50010.3—2011）測定。從-20℃冰箱中取出CBL粉末30 mg，加入無菌生理鹽水6 mL，然后配成5 mg/mL的CBL生理鹽水溶液，放在-20℃冰箱保存。

2.2 小鼠原代皮層神經細胞的培養

根據文獻報道［13］，將懷孕14 d的C57BL/6孕鼠用異氟烷麻醉，75%乙醇溶液噴灑于表皮，在超凈臺內取出胎鼠立即放入預冷的Hank's平衡鹽緩沖溶液中，在顯微鏡下分離出大腦皮質，除去血管和腦膜，加入等體積的0.25%胰酶室溫消化30 min，加入含10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化，離心，棄上清液，加入含10%FBS的DMEM/F12重懸均勻，70μm孔徑的細胞篩網過濾，制備單細胞懸液，以每孔4×105個細胞接種到多聚賴氨酸包被的24孔細胞培養板中，于37℃、5%CO2的細胞孵箱中培養。4 h后棄去培養基，換用含2%B27添加劑的Neurobasal培養基培養，每隔3天對小鼠原代神經細胞進行半量換液。

2.3 Neuro-2a細胞的培養

將Neuro-2a細胞用含10%FBS的MEM培養基于37℃、5%CO2的細胞孵箱中培養，每隔24小時換液。當細胞達到80%～90%融合度后用0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液備用。

2.4 蛋白免疫印跡分析

對細胞進行相應的處理后，棄掉細胞培養基，用預冷的PBS溶液洗滌3次，加入含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，轉移至新的1.5 mL離心管，用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度，加入適量的上樣緩沖液后，在95℃的金屬浴中加熱10 min，使蛋白變性。每個泳道加入同等質量的蛋白進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后轉至PVDF膜，隨后用5%BSA溶液封閉60 min；加入5%BSA溶液稀釋的一抗溶液（p-TrkB、TrkB、β-actin），4℃孵育過夜。用TBST緩沖液洗滌5次后用HRP偶聯的山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。隨后用ECL化學發光液孵育2 min，使用凝膠成像系統分析。用Image J軟件分析圖像灰度，以目的蛋白和其內參蛋白β-actin的光密度值做比值，作為目的蛋白的相對表達量，實驗重復3次。

2.5 細胞免疫熒光實驗

將Neuro-2a細胞、小鼠原代神經細胞接種于共聚焦小皿中，在37℃、5%CO2的細胞孵箱培養24 h，加入不同質量濃度（1μg/mL、5μg/mL）的CBL生理鹽水溶液，對照孔加入相應體積的生理鹽水，分別于24 h、48 h及72 h棄去小皿中的培養液，用預冷的PBS溶液洗滌3次；加入4%多聚甲醛固定30 min，用PBS洗滌3次；加入5%山羊血清溶液，室溫孵育1 h；棄掉5%山羊血清溶液后，加入5%山羊血清稀釋后的TUBB3一抗，4℃孵育12 h；用PBS溶液洗滌3次，然后用5%山羊血清稀釋后的羊抗鼠IgG二抗溶液，室溫避光孵育1 h；最后加入Hoechst 33342染液，采用激光掃描共聚焦顯微觀察并拍照保存，采用Image J軟件對圖像進行分析。

2.6 統計分析

實驗數據均采用GraphPad Prism 7.0進行統計學分析，數據均采用xˉ±s表示。單因素多組別之間用One-Way ANOVA加Bonferroni檢驗進行分析差異，多因素多組別之間用Two-Way ANOVA加Bonferroni檢驗進行分析差異。當組間差異P＜0.05，即認為組間差異具有統計學意義。

3結 果

3.1 CBL對低血清誘導Neuro-2a細胞軸突再生模型的作用

將Neuro-2a細胞接種在培養皿中，根據文獻報道［14］，用含有0.1%FBS的MEM培養基誘導其軸突再生；然后將1μg/mL和5μg/mL的CBL分別作用于Neuro-2a細胞24、48及72 h，對其進行免疫熒光實驗。結果如圖1所示，與溶劑對照組相比，1μg/mL和5μg/mL的CBL處理后的Neuro-2a細胞中，軸突長度以及有軸突細胞的數目顯著增加，且CBL質量濃度為5μg/mL，作用時間為72 h時，CBL促進Neuro-2a細胞軸突再生的作用最為明顯。

3.2 CBL對小鼠原代皮層神經細胞軸突再生的作用

為了探索CBL對小鼠原代神經細胞軸突再生的作用，將不同濃度的CBL分別處理小鼠原代皮層神經細胞，通過免疫熒光染色檢測小鼠原代皮層神經細胞中軸突長度及有軸突細胞的比例。結果如圖2所示，與溶劑對照組相比，1μg/mL、5μg/mL的CBL作用于小鼠原代皮層神經細胞24 h、48 h及72 h后，小鼠原代皮層神經細胞的軸突長度以及有軸突細胞的數目顯著增加（P＜0.001），并且當CBL質量濃度為5μg/mL處理原代皮層神經元72 h時，CBL促進原代皮層神經元軸突再生作用最強。

3.3 CBL對Neuro-2a細胞TrkB磷酸化水平的作用

為了研究CBL對Neuro-2a細胞軸突再生的作用機制，給予Neuro-2a細胞5μg/mL的CBL分別處理15 min、30 min及1，3，6，9，12 h，通過Western blot檢測CBL對Neuro-2a細胞TrkB磷酸化水平的影響。結果如圖3所示，與對照組相比，CBL作用0.5、1及3 h后能顯著上調Neuro-2a細胞的TrkB磷酸化水平。當CBL作用于Neuro-2a細胞1 h時，TrkB的磷酸化水平達到最高值，且與對照組有顯著性差異（P＜0.001）。

Figure 1 Effect of cerebroprotein hydrolysatefor injection(II)(CBL)on axon regeneration of Neuro-2a cells incubated with low serumA:Representative immunofluorescence staining for the TUBB3(red)in Neuro-2a cells treated with different concentrations of CBL for 24 h,48 h and 72 h after low serum culture,scale bar=100μm;B:Axon length of Neuro-2a cells was measured by Image J software;C:Percentage of the axon of cellswascounted by Image Jsoftware(xˉ±s,n=3)**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group

Figure2 Effect of CBLon axon regeneration of mouseprimary cortical neuronal cellsA:Representative immunofluorescence staining for the TUBB3(red)and Hoechst(blue)in mouse primary cortical neuronal cells treated with different concentrations of CBL for 24 h,48 h and 72 h,scale bar=100μm;B:Axon length of mouse primary cortical neuronal cells was measured by Image J software;C:Percentage of the axon of cells was counted by Image Jsoftware(xˉ±s,n=3)*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group

Figure3 Effect of CBL on the phosphorylation of TrkBat different time points in Neuro-2a cellsA:Neuro-2a cells were treated with CBL(5μg/mL)at the different timepoints,and theexpression of p-TrkBand total TrkBweredetected by Western blot;B:Quantitativemeasurement of theratio of p-TrkB/TrkBexpression by Image Jsoftware(xˉ±s,n=3)***P＜0.001 vs control group

為了研究CBL質量濃度與Neuro-2a細胞p-TrkB表達水平是否存在相關性，用0.2、1、5μg/mL的CBL溶液處理Neuro-2a細胞1 h，通過Western blot檢測不同質量濃度的CBL對Neuro-2a細胞內TrkB磷酸化水平的影響。結果如圖4所示，與對照組相比，5μg/mL的CBL處理后的Neuro-2a細胞中TrkB磷酸化水平顯著升高。

上述結果表明，當CBL質量濃度為5μg/mL、作用于Neuro-2a細胞1 h時，Neuro-2a細胞的TrkB磷酸化水平最高。

Figure4 Effect of CBL on the phosphorylation of TrkBin different concentrations in Neuro-2a cellsA:Neuro-2a cells were treated with different concentrations of CBL for 1 h,and the expression of p-TrkB and total TrkB were detected by Western blot;B:Quantitativemeasurement of theratio of p-TrkB/TrkBexpression by Image Jsoftware(xˉ±s,n=3)***P＜0.001 vs control group

3.4 CBL對小鼠原代皮層神經細胞TrkB磷酸化水平的作用

為了確定CBL對小鼠原代皮層神經細胞是否也存在這樣的機制，用5μg/mL的CBL處理小鼠原代皮層神經細胞15 min、30 min、1 h、3 h及6 h，通過Western blot檢測小鼠原代皮層神經細胞中TrkB磷酸化水平的變化。結果如圖5所示，與對照組相比，5μg/mL的CBL處理后，小鼠原代皮層神經細胞中TrkB的磷酸化水平顯著升高。當CBL作用于小鼠原代皮層神經細胞1 h時，細胞內TrkB的磷酸化水平達到最高值，且與對照組有顯著性差異（P＜0.001）。

為了研究CBL質量濃度與小鼠原代皮層神經細胞TrkB磷酸化水平是否存在相關性，用不同濃度的CBL溶液處理小鼠原代皮層神經細胞1 h，用Western blot檢測小鼠原代皮層神經細胞中TrkB的磷酸化水平。結果如圖6所示，與對照組相比，0.2、1或5μg/mL的CBL溶液處理過的小鼠原代皮層神經細胞中TrkB磷酸化水平顯著升高，并且當CBL質量濃度為5μg/mL時小鼠原代皮層神經細胞中TrkB磷酸化水平最高。

上述結果表明，當CBL質量濃度為5μg/mL，作用于小鼠原代皮層神經細胞1 h時，CBL能夠顯著上調細胞內TrkB的磷酸化水平，可能通過激活TrkB信號通路促進神經元軸突再生。

Figure 5 Effect of CBL on the phosphorylation of TrkBat different timepoints in mouseprimary cortical neuronal cellsA:Mouse primary cortical neuronal cells were treated with CBL(5μg/mL)at the different time points,and the expression of p-TrkB and total TrkB weredetected by Western blot;B:Quantitativemeasurement of theratioof p-TrkB/TrkBexpression by Image Jsoftware(xˉ±s,n=3)***P＜0.001 vs control group

4討論

中樞神經系統損傷后，通過軸突再生促進中樞神經系統的恢復，但由于自身再生能力差，以及微環境中的抑制因子，導致軸突再生失敗，無法修復損傷的中樞神經系統。有研究表明，腦蛋白水解物可以促進突觸的再生［15］，但不清楚CBL促進神經細胞軸突再生的作用及其分子機制。在本研究中，證明了CBL可以促進神經細胞軸突再生，可以上調神經細胞TrkB的磷酸化水平；當CBL作用于神經細胞1 h時，TrkB的磷酸化水平達到峰值，并且隨著CBL濃度的增加，TrkB的磷酸化水平也隨之增加，當CBL質量濃度為5μg/mL時可以顯著促進神經細胞軸突再生。因此，上調TrkB的磷酸化水平可能是CBL促進神經細胞軸突再生的重要分子機制，CBL可能通過激活TrkB信號通路促進神經細胞軸突再生。

原肌球蛋白相關激酶（tropomyosin related kinase，Trk）受體是酪氨酸激酶受體家族的一種，包括TrkA、TrkB和TrkC共3種亞型［16］。腦源性神經 營 養 因 子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是小分子多肽，在神經元的發育、受損神經元的修復和軸突的再生中發揮至關重要的作用［17］。BDNF和受體TrkB結合后，會激活3個主要的信號傳導途徑：磷脂激3（PI3K）、磷脂酶Cγ（PLCγ）和細胞外信號調節激酶（ERK）［18］。除此之外，BDNF也可以調節cAMP反應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），對神經細胞具有保護作用［19］。PI3K/AKT信號通路有助于穩定大腦內環境和保護神經元。中樞神經系統損傷后，通過PI3K/Akt信號通路逐級調節，促進3-磷脂酰肌醇依賴性的蛋白激酶-1（3-phos?phoinositide dependent protein kinase 1，PDK1）磷酸化，進一步激活雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和糖原合成激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3），促進蛋白的合成和軸突再生［20］。在中樞神經系統中，ERK的激活通過影響軸突的運輸、局部蛋白的合成和基因的表達來調節軸突的再生和神經元的存活。細胞培養和動物模型表明，ERK的信號傳導主要參與體外軸突的生長和體內遠距離神經再生［21］。BDNF和TrkB受體結合后，導致細胞內多種蛋白質（如PLCγ）磷酸化，進而激活Ras/MEK/MAPK途徑，促進細胞的增殖和分化［22］。

軸突再生的機制尚不清晰，可能涉及到多個神經遞質和細胞受體，但與TrkB的關系密切。Zheng等［23］發現補腎益穗配方可以通過調節BDNF-TrkB信號通路以及下游的PI3K/AKT信號通路促進軸突再生；使用小分子TrkB激動劑可以促進周圍神經切斷后的軸突再生［24］以及靶向TrkB可以促進髓鞘的再生，進一步促進軸突再生［25］。TrkB的激動抗體在體內體外模型中可以提高運動神經元的存活率，用于治療運動神經元的變性［26］，促進損傷后中樞神經系統的恢復，改善神經細胞的功能。Fan等［27］基于TrkB受體信號通路在軸突發芽、樹突狀喬木的增殖、突觸可塑性和神經元分化中起關鍵作用，使用TrkB的激動劑可以挽救神經元的丟失，對海馬神經元具有保護作用，可用于治療早期阿爾茲海默病。因此，細胞表面的受體TrkB是促進軸突再生藥物潛在的作用靶標［28］。此外，TrkB的完整性表達對于軸突再生至關重要，TrkB過表達可以促進神經細胞軸突再生［29］。在本研究中，實驗結果證明了CBL可以使神經細胞內TrkB的磷酸化水平上調，促進神經細胞軸突再生。這些研究都表明TrkB與軸突再生密切相關，靶向TrkB可以促進軸突再生。除了以上的信號通路，是否存在其他的信號通路調控軸突再生，這些信號通路中是否存在聯系，激活多個信號通路是否可以進一步提高神經細胞軸突再生的能力，這些問題都不是很清楚。所以，軸突再生的具體機制還沒有被真正闡明，仍然存在一些局限。

CBL是復合物，成分較為復雜，含有多種氨基酸和小分子多肽。本研究只是證明了CBL可以促進神經細胞軸突再生，無法確定其真正的有效成分。有研究表明，CBL中的有效成分為小分子多肽，發揮著神經營養因子的作用。因此，需要進一步確定CBL中與TrkB結合的多肽，確定CBL中促進神經細胞軸突再生的有效成分，以明確CBL臨床發揮藥效的有效成分。