NIH 稀毛小鼠認知情緒等行為學相關特性的測定

冀中豪，于小亞，任文陟，陳 健，胡進平*

1.長治醫學院基礎醫學部，山西長治 046000；2.吉林省科技創新平臺管理中心，吉林長春 130062；3.吉林大學動物科學學院，吉林長春 130062；

實驗小鼠是最常使用的一種模式動物，在生命科學和醫學研究中發揮著巨大的作用。NIH 稀毛小鼠是被毛異常的自發突變鼠，其背景品系是封閉群NIH 小鼠，為常染色體隱性遺傳。毛囊的生長發育包括形態發生和周期循環兩個階段，目前研究發現的多種被毛突變小鼠模型主要表現為周期循環階段的異常，例如典型的Hr 基因突變小鼠表現為漸進性脫毛，而NIH 稀毛小鼠屬于形態發生期存在異常表現為出生后一直保持稀毛甚至無毛的狀態。前期研究中對NIH 稀毛小鼠的皮膚結構和免疫相關的生物學特性進行了觀察和測定，發現NIH 稀毛小鼠表皮層增厚、毛發周期轉換異常，單增李斯特桿菌感染實驗表明相較于NIH 小鼠其免疫力降低。

使用最廣泛的一種被毛異常小鼠是裸小鼠，其胸腺缺失T 細胞缺陷而導致的免疫低下使其適用于腫瘤、免疫和感染等相關方向的研究。裸小鼠最顯著的表型是皮膚被毛異常，關注于這一表型可以將裸小鼠用于皮膚或毛發發育相關的研究，但是如果錯失了其胸腺缺失免疫缺陷這一表型，將是對這一模型資源的極大浪費。因此，在本研究中，我們將通過生理生化指標的測定和行為學相關的實驗來分析NIH 稀毛小鼠的相關生物學特性，完善其基礎信息，為實驗動物資源的開發和模型的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6 ～8 周齡的NIH 稀毛小鼠由吉林大學實驗動物中心提供，SPF 級6 ～8 周齡的NIH 小鼠購于長春生物制品有限公司，所有動物均飼養于吉林大學實驗動物中心，自由采食飲水，光暗周期12 h/12 h，所有操作符合實驗動物倫理福利規范的要求，具體實驗動物的分組和數量見各部分實驗設計，NIH 小鼠以NIH 表示，NIH 稀毛小鼠以HL 表示。

1.2 主要試劑和儀器

75%乙醇、英雄牌黑墨水、桂龍牌黃帽帶分離膠促凝血液采集管、富士干式生化儀、超凈工作臺、離心機、行為學配套設備及分析軟件。

1.3 血清生化指標的測定

8周齡雄性NIH稀毛小鼠和NIH小鼠各10只(雄性小鼠適應性強，狀態穩定，自身激素影響較小，常用于臟器功能性實驗)，摘眼球采血收集于黃帽采集管，4 000 rpm 離心15 min 收集上清液，使用生化儀上機檢測生化21 項指標。

1.4 開放曠場實驗

在60 cm（長）× 60 cm（寬）× 40 cm（高）的非透明無毒材質曠場中進行試驗。整個場地劃分為4×4 共16 個正方形小塊，中間4 個正方形區域為內區。開始攝像，選擇一個壁，然后輕輕地將鼠面壁由中點位置放入，記錄5 min 的運動軌跡。隨后使用蒸餾水和75%乙醇擦拭清潔實驗場地，防止排泄物及殘留氣味影響后續實驗。重復以上步驟，直到所有小鼠完成實驗。觀察記錄三個指標：總的運動距離、內區占比、內區穿越次數。

1.5 新物體識別實驗

實驗所用場地同上，新物體識別實驗包含三個部分：第一部分習慣場地（1.4 中已完成），第二部分熟悉舊物體，第三部分測試新物體識別情況。第二部分實驗使用5 cm（長）×5 cm（寬）×8 cm（高）的兩個紅色正方體積木作為舊物體，兩個積木通過雙面膠固定離壁5 cm 處，面向壁側中央放入小鼠探索活動5 min。第二部分實驗結束后3 h 進行第三部分，實驗時將其中一塊紅色正方體積木更換為黃色球體積木，直徑5 cm，同樣探索活動5 min，記錄小鼠探索新物體和舊物體的實驗占比。實驗設置為以小鼠鼻尖距物體2 cm 內視為對物體有探索行為。

1.6 高架十字迷宮實驗

在所有小鼠進行新物體識別實驗的后一天進行高架十字迷宮試驗，按照步驟1.6 所述清潔儀器。注：高架迷宮的結構為“十”形。它有兩個張開的手臂（30 cm×5 cm×0.5 cm），彼此交叉，垂直于兩個閉合的手臂（30 cm×5 cm×16 cm），中間有一個平臺（5 cm×5 cm×0.5 cm）。迷宮高出地面40 cm。將小鼠放開臂和閉臂的交界處，記錄5 min的探索行為。觀察記錄小鼠在張開臂（open）和閉合臂（close）中的時間，open/close 表示焦慮程度，記錄活動軌跡圖。

1.7 Morris 水迷宮實驗

實驗所用場地為直徑120 cm、高60 cm 的圓形水池，等分為四個象限。實驗前一天清洗水池并注水，加入6 mL 黑墨水增強小鼠與背景反差，設置儀器參數。首先進行可視化平臺實驗，即目標平臺高于水面在小鼠視野范圍內，該實驗結果將反應小鼠的視力和游動速度對后續實驗的影響；其次進行定向航行實驗訓練小鼠尋找目標平臺，此時目標平臺在水下1 cm 處，小鼠無法直接觀察到，實驗結果反應小鼠的學習能力，該部分實驗為期4 d，每天訓練4 次，每次由不同象限入水；最后進行空間探索實驗，將目標平臺撤離，小鼠由對側象限入水，觀察小鼠在目標平臺所在象限的停留時間，穿梭進入目標平臺的次數等，實驗結果反應小鼠的空間記憶能力。

1.8 統計分析

使用Graphpad Prism 軟件（8.2.1 版本）進行數據的統計分析和繪圖展示，實驗結果以平均值±標準差表示，組間比較采用雙尾T 檢驗，*表示p＜0.05、**表示p＜0.01。

2 結果

2.1 NIH 稀毛小鼠血清生化指標的檢測結果

血清生化指標主要包括肝功能、腎功能、血脂、血糖等指標，能夠反應肝臟腎臟的基本狀態。檢測結果表明，相較于NIH 小鼠，NIH 稀毛小鼠肝功相關的的ALT、AST 和D-BIL 顯著升高（p＜0.05），CHE、TP 和ALB 顯著升高（p＜0.0001），ALP 顯著降低（p＜0.01）；腎功相關的BUN 降低（p＜0.05），AU 升 高（p＜0.01）；血 脂 相 關 的TG 顯 著 升 高（p＜0.05）。結果指示NIH 稀毛小鼠的肝功和腎功存在異常。相關結果見表1。

表1 8 周齡雄性NIH 稀毛小鼠和NIH 小鼠血清生化指標

2.2 開放曠場實驗結果

曠場實驗通過觀察小鼠在場地中間區域和外周曲線的活動情況，基于運動距離，穿梭次數和停留時間等指標來評價受試物在新異環境中的活動量和探索情況。5 min 的曠場實驗結果表明，NIH 稀毛小鼠（HL）與NIH 小鼠（NIH）在活動量上無明顯區別（圖1A）；但是通過對小鼠在中央區域的活動時間（圖1B）和穿入次數（圖1C）進行統計發現，NIH 稀毛小鼠相較于NIH 小鼠具有更強的探索行為。

2.3 新物體識別實驗和高架十字迷宮實驗結果

新物體識別實驗通過設置顏色及性狀各異的兩類探索物，基于小鼠對新異食物的探索偏好度來反應小鼠的短時記憶。實驗結果表明，在5 min 的測試時間中，兩種小鼠的新物體識別能力無明顯區別（圖2A）；高架十字迷宮則是通過設置敞臂和開臂兩種探索區域來測定小鼠的焦慮樣表現。實驗結果表明，NIH 稀毛小鼠有明顯的焦慮樣行為，具體表現為開閉壁探索比例顯著低于NIH 小鼠（p＜0.0001）（圖2B），運動軌跡圖直接展示了小鼠的探索活動行為（圖2C、D）。

圖1 OFT 實驗結果

圖2 NOR 實驗和EPM 實驗結果

2.4 Morris 水迷宮實驗結果

Morris 水迷宮實驗包含兩個階段的內容，能夠對動物的學習能力和空間記憶能力進行評價。首先將目標平臺置于水面之上進行可視化平臺測試，結果表明兩組小鼠的視力正常并且游動速度不會影響實驗結果（圖3A）；為期4 d 的定向航行實驗訓練小鼠尋找隱藏的平臺，結果表明隨著訓練的進行兩組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短，但兩組之間無明顯區別（圖3）；圖3C、D 展示了訓練第4 天兩組小鼠的運動軌跡。

圖3 Morris 水迷宮定向航行實驗

第5 天撤去隱藏平臺進行空間探索實驗，小鼠由目標象限對側入水（圖中右上角圓點表示入水點，下半區域圓點表示實驗結束時小鼠的停留位置），在測試時間60 s 中NIH 稀毛小鼠進入目標象限的次數顯著多于NIH 小鼠（圖4A），在目標象限的停留時間比例也顯著高于NIH 小鼠（圖4B），表明NIH 稀毛小鼠的空間記憶能力強于NIH 小鼠。圖4C、D 展示兩組小鼠的運動軌跡。

圖4 Morris 水迷宮空間探索實驗

3 討論

小鼠模型是生命科學和醫學研究中最常使用的模型。被毛突變小鼠是其中的一種，在皮膚光老化、毛發生長周期的調控機制、腫瘤、感染和免疫方面有著廣泛的應用。NIH 稀毛小鼠是一種自發性的被毛突變鼠，前期的研究表明其毛囊形態發生和周期循環存在異常，取雌性42 日齡NIH 稀毛小鼠和NIH 小鼠的背部皮膚進行了轉錄組測序，構建了差異基因表達譜，NIH 稀毛小鼠可以用于毛囊發育相關的研究。皮膚是機體免疫的第一道屏障，毛囊的異常影響皮膚穩態，通過單增李斯特桿菌感染實驗對NIH 稀毛小鼠的先天免疫能力進行了測定，評估了了腸道菌群對實驗結果的影響，表明NIH 稀毛小鼠有用于免疫、腫瘤研究的潛力。

為了進一步完善NIH 稀毛小鼠的生物學特性，加深對這一新型實驗動物模型的認識，在本研究中對NIH 稀毛小鼠的生理生化指標和行為學相關的生物學特性進行了測定和分析。結果表明，NIH 稀毛小鼠的肝功異常，可以嘗試將NIH 稀毛小鼠用于肝炎、肝損傷模型的研究。通過曠場實驗、新物體識別實驗、高架十字迷宮實驗和Morris 水迷宮實驗對NIH 稀毛小鼠的活動量、記憶、探索和焦慮行為進行了測定分析，結果表明NIH 稀毛小鼠的空間記憶能力增強，探索行為增強但是呈現出對高懸開臂的恐懼樣的焦慮行為，NIH 稀毛小鼠在行為學方面的特性提示其可能適合應用于記憶焦慮相關的藥理或毒理實驗。

此外，NIH 稀毛小鼠是一種自發突變鼠，遺傳學實驗表明這是一種常染色體單基因隱性突變，通過全基因組重測序將突變基因定位到了14 號染色體，對NIH 稀毛小鼠表型的分析將揭示突變基因的潛在功能，為后期突變基因的精細定位和驗證提供了有利支撐。