番茄葉衰老誘導質體小球降解的亞細胞途徑分析

李 沫，王 靜，何金銘，陳雯新，劉 林，張桂芝*，趙小梅

（1.臨沂大學藥學院，山東臨沂 276005；2.臨沂大學生命科學學院，山東臨沂 276005）

電子顯微鏡下觀察葉綠體，會看到一種嗜鋨顆粒[1-5]，進一步研究顯示這些嗜鋨顆粒是由膜脂單分子層包圍三酰甘油、戊烯基醌、類胡蘿卜素等中性脂核的細胞器，稱為質體小球[6-8]。質體小球單分子層膜上結合著維持小球形態結構的蛋白和負責脂代謝的酶[9-10]。質體小球的產生機制是類囊體膜局部區域兩分子層之間積累中性脂，中性脂積累引起膜膨大，膨大部分最終成為質體小球[10-13]。

除參與葉綠體的發育[14-17]及對多種環境脅迫的抵御[18-26]之外，質體小球的另一個重要功能是在葉綠體衰老過程中發揮解毒作用。首先，葉綠體衰老時葉綠素分解，在脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶作用下分解產生葉綠醇[27-28]，葉綠醇對細胞有毒性，必須通過代謝將毒性消減[29]，質體小球通過膜結合的酶將葉綠醇轉化為α-生育酚[29-30]或脂肪酸-葉綠醇酯，并貯藏在質體小球中[10,31-32]，從而將葉綠醇毒性最小化。其次，葉綠體衰老時類囊體膜解體，半乳糖脂水解產生脂肪酸，脂肪酸有毒[33-34]，質體小球通過膜結合酶將脂肪酸轉化為甘油三酯并貯藏在質體小球中[31-32]。這些源于類囊體的代謝產物在質體小球中積累，導致質體小球體積增大[35]。然而，對于這些體積增大了的質體小球的作用機理還有待于進一步研究。

番茄是廣泛栽培的園藝作物，葉衰老引起胞質脂滴出現[36]，但質體小球的變化和活動還未見報道。因此，本研究對衰老葉中的質體小球進行了超微觀察，以期了解質體小球的亞細胞降解途徑，為進一步研究質體小球降解的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試番茄（Solanum lycopersicum）品種為‘諾亞透明粉’，源自山東省壽光市惠友種苗有限公司。

四氧化鋨（分析純），TED PELLA INC，戊二醛（分析純）和樹脂（分析純），Structure Probe INC，磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、酒精（分析純）和丙酮（分析純），天津市鑫鉑特化工有限公司。先用磷酸鹽配制0.05 mol/L 緩沖液，再用緩沖液配制2%戊二醛溶液和1%四氧化鋨溶液。

1.2 儀器與設備

透射電子顯微鏡為JEOL 1220（JEOL），切片機為ULTRACUT R（Leica）。

1.3 方法

實驗于2017—2018 年進行，每年1 月下旬溫室育苗，4 月中旬露地定植，6 月下旬取成熟葉和衰老葉進行超微觀察。圖1 中成熟葉的葉片充分擴展（圖1A），衰老葉則明顯失綠（圖1B）。

圖1 番茄成熟葉（A）和衰老葉（B）Fig.1 Mature（A）and senescent（B）leaves of tomato

1.4 透射電子顯微技術

從大田植株切取小塊葉片，立即浸沒在2%戊二醛固定液中，在實驗室內切除葉片受傷邊緣，中央部分切成小于1 mm×1 mm 的小塊，放回2%戊二醛固定液中繼續固定，時間總計達12 h，期間抽出葉組織內的氣體。樣品經0.05 mol/L 磷酸緩沖液洗滌后，用1%四氧化鋨溶液固定2 h。之后用乙醇脫水，再用丙酮置換出樣品中的乙醇，將樣品包埋于Embed-812 樹脂中，切片，厚度為60 nm。切片用5%醋酸鈾染色10 min，再用0.1%檸檬酸鉛染色2 min，透射電子顯微鏡下觀察質體小球[5,36,38]。

1.5 數據處理

用SPSS 數據分析軟件對葉衰老前后的質體小球數量、直徑和體積進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 葉衰老前后質體小球大小和數量變化

表1 葉衰老前后葉綠體每個切片上質體小球數量、直徑和體積Table 1 Plastoglobule number,diameter and size per section of the chloroplast in leaves before and after senescence

表1 顯示了葉衰老前后葉綠體切片上質體小球的數量、直徑和體積。直徑從0.08～0.13 μm，平均直徑（0.1±0.03）μm。按照直徑平均值，成熟葉質體小球的體積平均為6.7×10-4μm3。

圖2 成熟葉中的質體小球Fig.2 Plastoglobules in mature leaves

圖2 為番茄成熟葉的葉綠體，葉綠體不同切片上質體小球數量差異表明質體小球在葉綠體內的分布極不均勻，番茄成熟葉葉綠體每張切片上都含有質體小球，但不同切片上質體小球數量差別很大，少者僅幾個，多者十幾個，質體小球電子密度大，呈現為黑色顆粒。

由表1 知，衰老葉不同切片上質體小球數量差異較大，少至2 個，多達7 個，平均（5.00±1.8）個。衰老葉葉綠體中的質體小球數量與成熟葉基本沒有差別，但是質體小球的體積顯著增大，直徑為0.42～0.80 μm，平均直徑（0.56±0.12）μm，約為成熟葉質體小球平均直徑的5.6倍。按照直徑平均值，衰老葉質體小球體積平均為1.1×10-1μm3，較葉衰老前明顯增大。

與成熟葉相似，衰老葉葉綠體每張切片上也都含有質體小球（圖3、4），與成熟葉相比，衰老葉的質體小球電子密度大大降低，除表面仍然呈黑色外，內部變淺至灰色（圖3），僅個別質體小球保持較大的電子密度（圖4A～C）。

圖3 衰老葉中的質體小球Fig.3 Plastoglobule in senescent leaves

圖4 衰老葉質體小球的降解Fig.4 Plastoglobule degrdation in senescent leaves

2.2 衰老葉中質體小球的活動

衰老葉中的質體小球有兩種值得注意的活動。第一種是向葉綠體外分泌，如圖3A 所示，有一個胞質脂滴與葉綠體相連，雖然沒有規則的形狀，但具有與質體小球相似的電子密度，根據密切的位置關系和相似的電子密度判斷，這個胞質脂滴是剛從葉綠體內分泌出來的質體小球。在圖3B 中，葉綠體中央的質體小球具有圓形輪廓，而葉綠體邊緣的質體小球失去圓形輪廓，呈彎月形，顯示是不完整的質體小球，彎月形的凹面正對著葉綠體外的胞質脂滴。胞質脂滴緊貼著葉綠體，并向著葉綠體內彎月形質體小球的凹面突起，間隙極小，顯示質體小球正在向葉綠體外分泌，胞質脂滴就是從葉綠體分泌出來的質體小球。胞質脂滴沒有固定的形狀，與質體小球形成鮮明對比。質體小球從相鄰葉綠體分泌出來后立刻融合成一個胞質脂滴，這與質體小球明顯不同（圖3B）。較大的胞質脂滴，尤其是剛從葉綠體分泌出來的較大脂滴，其電子密度與質體小球類似，而較小的脂滴，尤其不與葉綠體接觸的胞質脂滴，通常具有很高的電子密度（圖4B）。胞質脂滴會出現在中央大液泡中，在液泡內發生降解（圖4A、B）。觀察表明細胞質中沒有包裹著脂滴的自噬小體。脂滴往液泡內突入（圖3A），顯示脂滴直接被液泡吞噬。與衰老葉不同，成熟葉沒有質體小球向葉綠體外分泌的活動，細胞質中也沒有胞質脂滴（圖2），顯示質體小球向葉綠體外分泌并進入液泡的活動只在衰老葉內發生。

質體小球的另一種活動是它在葉綠體內發生原位降解。質體小球降解時，伴隨出現一個電子密度較低或透明的斑（圖3A、B），然后透明斑不斷擴大（圖4B～D），顯示降解從一點開始，向四周擴展。隨著體積不斷增大，透明斑顯示不同的形狀，如圖4B 所示，透明斑變成了圓形，而在圖4C 和4D 中，透明斑變成了凸透鏡形。圓形透明斑套在質體小球內部（圖4B），凸透鏡形透明斑則與質體小球并列（圖4C、D）。不同的位置關系是切片角度不同造成的，如果切片方向與連線平行，則透明斑與質體小球并列（圖4C、D）；如果切片方向與透明斑和質體小球中心連線垂直，則透明斑位于質體小球內部（圖4A、B）。透明斑與質體小球接觸面上質體小球凹陷，而透明斑凸起，透明斑與質體小球構成橢球形（圖4C、D）。透明斑與葉綠體基質之間的界面上有膜（圖4C），表明透明斑實際上是小泡。

圖5 質體小球（PG）降解與小泡（V）關系示意圖Fig.5 Diagram of the association between plastoglobule (PG)and vesicle (V)

圖5 顯示了質體小球（PG）降解與小泡（V）關系，由圖知，小泡隨著質體小球的降解而不斷增大；降解程度越大，小泡就越大（圖5）。在葉綠體切片上，不是所有質體小球都發生原位降解，表明質體小球的原位降解是不同步的。

3 討論

本研究顯示，番茄衰老葉中質體小球顯著增大，但數量并無明顯變化，體積增大了的質體小球接下來進行兩種活動：一是向葉綠體外分泌，然后進入液泡內降解；二是在葉綠體內發生降解。脂滴在葉綠體內的降解也稱原位降解[37-38]。

番茄衰老葉中質體小球分泌到葉綠體外成為胞質脂滴，來自質體小球的胞質脂滴形狀不規則。脂滴的形狀取決于其表面上的結構蛋白組分，結構蛋白組分改變，脂滴形狀就會隨之改變[39]。質體小球表面約有30 種蛋白質，多數為結構蛋白，少數為酶[16,19,40]。其中含量最為豐富的是纖維蛋白，屬于結構蛋白，以纖維形式存在于質體小球表面，形成質體小球疏水核與葉綠體基質親水環境之間的相容性界面，從而維持質體小球結構的穩定性，防止質體小球彼此合并[39,41-42]。番茄葉衰老過程中，質體小球從葉綠體分泌出來就失去了原來的形狀，而且彼此易于合并，與質體小球形成鮮明對比，這意味著質體小球在分泌過程中失去了相關的結構蛋白，這些結構蛋白的缺失使得離開葉綠體的質體小球無法維持穩定形狀和彼此獨立，相互之間極易合并。

番茄衰老葉內，質體小球從分泌到進入中央大液泡，體現了降解的液泡途徑。質體小球向液泡外分泌而成為胞質脂滴，但細胞質中沒有積累大量胞質脂滴，這與之前的觀察結果類似[36]。可能質體小球分泌到葉綠體外之后不久就進入液泡內降解，所以胞質脂滴不會大量積累。細胞組分進入液泡內發生降解的過程屬于自噬[43]，自噬分為巨自噬和微自噬，先形成自噬小體再被液泡吞噬稱為巨自噬，直接被液泡吞噬稱為微自噬[44]。番茄衰老葉內沒有觀察到包含脂滴的自噬小體，脂滴直接被液泡吞噬，所以脂滴進入液泡的過程屬于微自噬。研究表明葉衰老后自噬相關基因和定位于液泡的的脂酶基因表達水平急劇升高[45-48]，為脂滴降解的液泡途徑提供了分子基礎。要了解番茄衰老葉內自噬相關基因以及定位于液泡的脂酶基因的表達水平變化情況，還需要進一步探索。

番茄衰老葉綠體內質體小球降解伴隨透明斑的發生，暗示質體小球降解遵循一條小泡途徑。利用蛋白質組技術在質體小球上發現了PES1 和PES2[9]，兩個屬于酯酶/脂肪酶/硫酯酶家族的成員。這兩種酶都具有二酰甘油酰基轉移酶活性，催化脂肪酸與二酰甘油反應生成三酰甘油，脂肪酸與葉綠醇反應生成脂肪酸葉綠醇酯[31-32]。在衰老葉中，這兩種酶的表達水平急劇升高[31]。然而，質體小球上缺少負責甘油三酯水解的脂酶[9]。如果質體小球在葉綠體內降解，一個關鍵問題是，脂酶從何而來。首先考慮一下位于細胞質基質中的胞質脂滴，其表面也沒有脂酶，其降解遵循液泡途徑或乙醛酸循環體途徑[49-50]。在液泡途徑中，液泡為脂滴提供脂酶；在乙醛酸循環體途徑中，乙醛酸循環體將脂酶輸送到脂滴表面[49]。乙醛酸循環體途徑發生于發芽種子中。油性種子發芽時，乙醛酸循環體與脂滴接觸，從而將脂酶呈遞到脂滴表面，脂酶催化貯藏脂水解，產生脂肪酸[49]。游離脂肪酸有毒[33-34]，過氧化物酶體將其收集，通過β-氧化途徑和乙醛酸循環途徑將脂肪酸轉化成無毒性的琥珀酸，琥珀酸離開乙醛酸循環體進一步轉化成可運輸的糖，供幼苗生長所需[49]。脂酶要作用于質體小球，需要先跨越葉綠體膜，再以某種方式傳遞到質體小球表面。本研究顯示，番茄質體小球在葉綠體內降解時伴隨產生透明斑，透明斑有膜邊界，實質上是一種小泡。小泡與質體小球的密切聯系讓人聯想到種子發芽時乙醛酸循環體與胞質脂滴的相互作用，產生對小泡是否像乙醛酸循環體那樣參與質體小球降解的猜測。與乙醛酸循環體比較，小泡有一個特別之處，即它的體積隨著質體小球的降解而不斷增大。本研究為質體小球降解的生化分析提供了基礎。

4 結論

顯然，葉衰老誘導質體小球體積增大，并導致質體小球通過兩條亞細胞途徑降解：一條途徑是質體小球分泌到葉綠體外之后再轉運到液泡內，在液泡內降解；另一條途徑是在葉綠體內通過小泡的參與而降解，表現為正在降解的質體小球總是與小泡相聯系。小泡途徑降解的分子機制還不清楚，是未來需要解決的問題。了解質體小球降解的分子機制有助于探索葉片的衰老機制，并進一步實現對衰老葉大分子養分的回收利用。