果蔬氧化還原防御系統研究進展

林少華，張曉軍，張慧杰，賈紅亮，潘 妍，羅紅霞*

（1.北京農業職業學院食品與生物工程系，北京 102442；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；3.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457）

蔬菜和水果的營養豐富，是人類所需的維生素、礦物質和膳食纖維等許多重要營養素的主要來源，也是人們日常健康飲食的重要組成部分。全球每年的水果和蔬菜總產量很高，但是由于它們存在季節性、地區性及易腐性，采摘后仍然進行著旺盛的代謝活動，在目前貯藏能力不足、關鍵技術缺乏、產業體系不健全等情況下，果蔬自身極易衰老變質，并可能同時受到機械損傷、微生物侵染和冷害等威脅，降低了其食用品質和商品價值，從而限制了果蔬產業的發展。隨著人們生活品質的不斷提高，新鮮、健康、天然、營養的果蔬越來越受到人們的歡迎，需求量也越來越大，因此延緩果蔬衰老，抑制果蔬采后品質下降是農產品貯藏行業目前面臨的最大挑戰，而植物的氧化還原防御系統在調控果蔬衰老變質過程中起到了非常重要的作用，植物體內許多重要的細胞過程涉及氧化還原反應，如分解代謝/合成代謝、蛋白質構象的變化和應激等[1]。

在大多數需要氧氣來維持生命的植物中，大部分生理代謝是依賴于氧化還原反應來進行細胞的能量生產、細胞增殖、細胞分化和凋亡等。而參與這些過程的氧化劑和還原劑有輔酶（NAD+/NADH，NADP+/NADPH）、硫醇（谷胱甘肽）和活性氧（超氧陰離子、過氧化氫）、抗壞血酸等物質[2]。尤其是作為還原劑的活性氧，對平衡植物氧化還原反應和調控逆境脅迫抗性有重大影響。有研究表明植物體的衰老劣變與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的調節密切相關[3]。ROS 主要是指超氧陰離子自由基（O2-·）以及O2-衍生物質，它是植物生理代謝的必然產物。當ROS 的產生超過植物的氧化防御范圍時，就會引起細胞損傷甚至死亡[4-5]。因此，清除果蔬體內的ROS 是保持水果新鮮度和提高抗氧化能力不可分割的一部分。植物活性氧水平受多種因素影響，外源因素包括污染、輻射、煙草、外源性物質，而內源因素主要是由活性氧代謝轉化造成的?；钚匝踉诙喾N組織細胞中產生，并與許多信號通路和相關酶反應[6]。因此，探究果蔬采后氧化還原防御系統的作用機制和ROS 代謝的調控機理對貯藏保鮮精準控制技術的研究有重要意義，對延長果蔬貨架期、減少損失具有指導意義。

1 果蔬體內活性氧的產生及特點

活性氧（ROS）包括羥自由基（·OH）、超氧化物自由基（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、單線態氧（1O2）、脂類過氧化物（ROO·）和烷自由基（R·）等類型[7]，是細胞在生理代謝過程中產生的一類含氧的、化學性質活潑、存在時間短、氧化能力極強的代謝產物及其衍生物的總稱[8]。植物細胞在生物和非生物脅迫下，如衰老、干燥、冷害、高溫、病原微生物侵害等，在有氧呼吸和光合作用過程中通過O2的還原不斷產生ROS[9]。目前已在葉綠體、過氧化物酶體、線粒體等細胞內以及植物細胞壁和質膜等細胞外兩種途徑中檢測到ROS[10]。其中，細胞內葉綠體活性氧主要通過類囊體、葉綠體基質和黃素脫氫酶這3 個途徑產生，線粒體則主要是在內膜上產生[11]。而在細胞外基質產生活性氧的主要途徑是植物體內細胞質膜電子傳遞系統或質膜氧化還原系統。

研究表明，少量的ROS 在植物發育中具有重要的生理作用[12]，可作為信號轉導分子控制細胞生長發育以及適應環境變化等一系列生理過程，并可作為細胞壁松懈劑[13-14]。然而，活性氧是植物在成熟衰老過程中產生的代謝副產物，是一類能夠損傷細胞的毒性物質，過量的ROS 會引起氧化應激，導致蛋白質變性損傷和脂質過氧化以及DNA 損傷等多種不良反應，參與果實衰老的特殊線粒體蛋白已被確定為ROS 的作用靶點[15]。研究還發現，ROS 會提高果蔬的呼吸強度，降低維生素C、總糖等營養物質的含量，加速果肉軟化及自溶，從而降低硬度，促進果皮褐變進程[16]，因此，ROS 的大量積累是造成果蔬衰老、品質下降的主要原因之一。用于檢測細胞內ROS 含量的試劑有5-（和-6）-羧基-2’,7’-二氫二氟熒光素二乙酸酯（H2DFFDA）、二氫羅丹明甲酯（DHR123）、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）等。此外，基因編碼熒光蛋白指示劑已被開發用于體內檢測細胞ROS 的變化，但存在蛋白質表達困難、pH 敏感性強和細胞毒性大等缺點[17]。

2 果蔬的氧化還原防御系統及其作用機理

果蔬細胞中存在一套復雜完整的氧化還原防御系統（reduction oxidation system，redox-system），能夠調節細胞的氧化還原狀態。當植物體內產生ROS 時，會自動激活這套氧化還原防御體系，通過增加抗壞血酸和還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）等抗氧化物質的含量[18]，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化物酶的活性[19]，保護其不被ROS 損傷。這套系統包括酶促體系和非酶促體系[17]，當植物產生過多的ROS時，這兩套體系將會協同作用清除ROS，進而維持ROS產生與清除系統的平衡[8]。然而，在非生物因子逆境脅迫下，如高溫、機械損傷、病原菌侵染等，會干擾ROS-Redox 動態代謝平衡，導致ROS 的過度積累、相關內源抗氧化物質含量和ROS 清除酶活性下降，從而引起采后果蔬ROS 代謝失衡，進而加劇呼吸紊亂、生物膜功能喪失、能量供應不足等問題[20]，使采后果蔬品質劣變，嚴重影響其貯藏保鮮和銷售[7]。

2.1 酶促抗氧化系統

2.1.1 作用機理

酶促抗氧化系統主要通過SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、POD 和谷胱甘肽S-轉移酶（GST）等清除ROS[17,21]，因此，它們活性的高低對保持植物體內ROS 的平衡十分重要。

SOD 分布于葉綠體、線粒體、細胞溶質等多個部位，可以通過歧化反應將O2-·催化成毒性較低的H2O2和O2，阻止·OH 的合成，以清除超氧自由基，CAT 協同SOD 進一步將H2O2轉化成為H2O 和O2，從而對氧化損傷起到防御作用[22]。CAT 和SOD 的協同催化反應在防御超氧自由基損傷方面起著至關重要的作用[23]。超氧化物歧化酶的活性部位含有銅、鋅、錳三種不同金屬離子，作為其功能的輔助因子。其中，銅鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）存在于細胞質、線粒體膜間隙和細胞核中，而錳超氧化物歧化酶（MnSOD）存在于線粒體基質中[24]。

POD 普遍存在于植物細胞內，含有一個Cys47 殘基，可被過氧化氫、脂質過氧化物和過氧亞硝酸鹽等過氧化物底物氧化成半胱氨酸磺酸（Cys-SOH），Cys-SOH 在另一種過氧化物酶中進一步與Cys47-SH 相互作用形成二硫鍵[25]，并被谷胱甘肽等供體還原[26]。POD 既能在催化過程中產生自由基，加劇組織氧化，又能通過催化與CAT 協作將低濃度的H2O2分解并清除。研究發現，POD 可減少細胞溶質和線粒體中約90%的H2O2[27]。

此外，APX 在抗壞血酸鹽的作用下，通過抗壞血酸-谷胱甘肽循環反應，可將抗壞血酸和H2O2轉化為水和脫氫抗壞血酸，還可協助POD、CAT 和酚類將H2O2還原為水，從而清除體內的活性氧，緩解ROS 對機體的毒害作用[28]。GPX 作為一種含硒酶，在作為氫供體的條件下可以還原H2O2，維持細胞的正常生理功能[17]。GST 可以催化谷胱甘肽（GSH）與許多非極性小化合物（如醌類化合物）的結合，以抵御醌類化合物引起的氧化應激[29]，在GSH 作為輔助因子的情況下，能夠將有機過氧化氫還原為醇，并在抗氧化防御系統中發揮重要作用[30]。低濃度ROS 可通過誘導脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）的降解、防御信號分子的生物合成以及植物抗性基因的表達，在植物體內起到防御傷害的作用[31]。通常植物體內的第一道抗氧化防線以SOD 對于超氧陰離子的轉化為主，第二道防線以CAT 和GPX 等酶的共同作用為主[10]。

2.1.2 果蔬酶促抗氧化的研究進展

活性氧在植物體內的爆發在果實成熟衰老過程中扮演著重要作用，過量的活性氧累積會引起果實衰老或凋亡。由此，果實自身在應對不同環境脅迫（冷害、病害、鹽脅迫、機械損傷等）會進行相應的ROS 響應，通過酶促抗氧化系統發揮作用使細胞內的ROS 水平得以平衡，以維持采后果實品質[32]。大量研究表明，抗氧化劑系統能參與低溫脅迫下水果中活性氧的調控。Yoshihiro 等[33]通過將李子存儲在不同溫度下發現，6 ℃時李子過氧化氫含量高于1 ℃，且總抗氧化能力（TAC）、SOD、CAT、APX 的活性較低，導致6 ℃的果實具有更大的氧化應激，從而冷害癥狀比在1 ℃下更為嚴重。Siboza 等[34]用茉莉酸甲酯（MJ）和水楊酸（SA）處理檸檬，可誘導其體內酶促抗氧化劑的產生來增強果實的耐寒性，CAT、APX 和GR 等抗氧化酶參與了對MJ 和SA 處理檸檬的耐寒性傳遞。這一研究結果與Araújo 等[35]的結果相似，CAT 和APX 活性降低造成了H2O2的積累，酶促應激誘導的CAT 和APX 活性增加在甘薯抑制H2O2含量中起著重要作用。

病害脅迫能夠對果蔬酶類抗氧化劑活性產生影響，從而對ROS 的積累產生影響。部建雯等[36]發現核盤菌接種之后的黃瓜體內POD、SOD、APX 活性表達升高。王岳霞等[37]也認為青枯菌侵染茄子嫁接植株時，會使植株體內超氧陰離子和H2O2積累，從而引發酶促抗氧化清除系統中CAT、SOD、POD、PPO、APX 以及GR 等抗氧化酶的活性增強以抵御病原菌侵害。龐強強等[38]發現高溫處理后的菜心體內MDA 含量顯著升高，且POD、SOD、CAT等抗氧化酶的活性也增加，另外Mn-SOD、POD 和CAT基因表達量顯著增加。Maurer等[39]研究發現紫外線（UV-C）照射處理能夠促進葡萄的CAT、APX、GR 等抗氧化酶活性的提升，同時也提高了葡萄的抗氧化能力。陳存坤等[40]發現臭氧處理能誘導草莓的氧化防御系統，通過刺激酶促防御反應中重要抗氧化酶（SOD、CAT、APX）活性的提高來應對氧化脅迫，減少草莓中活性氧的積累。

2.2 非酶促抗氧化系統

植物體內的非酶促抗氧化系統主要是指具有還原性等生物活性的、能與活性氧發生一系列反應從而達到清除活性氧的物質[10]。

2.2.1 作用機理

非酶促抗氧化系統主要包括還原性谷胱甘肽（GSH）和抗壞血酸（ASA）等幾十種化合物[7,17]。它們既可直接消除ROS，同時又可作為酶的底物在ROS清除中發揮作用[10]。植物體內重要的非酶類抗氧化物質主要是ASA 與GSH，它們能夠在逆境脅迫過程中直接清除植物體內過量的·OH、O2-·和H2O2等活性氧物質，或通過ASA-GSH 循環途徑的偶聯反應將活性氧還原為水或醇等不易揮發的化合物[41-42]，以有效減少細胞內MDA 的積累，保護膜結構并修復自由基引起的氧化損傷，使植物在一定程度上抵抗逆境脅迫，從而延緩果蔬組織的衰老進程[7,43-45]。此外，谷胱甘肽還原酶和抗壞血酸過氧化物酶的協同作用能夠確保內源性谷胱甘肽和抗壞血酸在植物細胞內維持抗氧化系統高效運行所需的高水平[46]?？箟难峥赏ㄟ^降低MDA 的含量，抑制膜脂過氧化作用[22]。GSH 是細胞內主要的含巰基化合物，除了直接清除自由基之外，還可作為SOD、CAT 和APX 等抗氧化酶的輔助因子，保持蛋白質巰基處于還原狀態，并再生抗壞血酸等抗氧化劑的活性形式[47]。因此，GSH 氧化是非生物脅迫的一個生化特征，其通過谷胱甘肽還原酶活性的再生在清除ROS 中起到非常重要的作用[42]。

2.2.2 果蔬非酶促抗氧化的研究進展

果蔬氧化還原防御系統不僅包括酶促反應，同時還存在非酶促反應。當活性氧的積累與代謝失衡造成果蔬衰老腐敗時，非酶促反應在平衡氧化還原方面同樣起重要作用，它通過與酶促反應的協同作用直接或間接達到清除過量活性氧的目的，使植物細胞內的活性氧產生和清除處于動態平衡。

抗壞血酸-谷胱甘肽循環（AsA-GSH）是近年來的研究熱點，該循環對活性氧的清除有重要作用。特別是在CAT 不足的情況下，果蔬細胞中產生的H2O2主要是由ASA-GSH 循環清除[48]。Ali 等[49]研究發現經過臭氧熏蒸的番木瓜非酶促抗氧化系統中抗壞血酸、β-胡蘿卜素、總酚含量增加，尤其是抗壞血酸。Hasan 等[50]發現外源性GSH 處理番茄能顯著減少ROS 的積累、增加一氧化氮（NO） 和亞硝基硫醇（SNO） 的含量，并通過平衡ASA-GSH 循環，利用氧化還原機制刺激抗氧化系統，以此提高番茄對鎘（Cd）脅迫的耐受性。Zhang 等[48]研究也發現臭氧處理可通過提高草莓ASA 和GSH 的累積提高超氧陰離子、過氧化氫的清除效率，維持采后草莓品質。此外，楊乾等[51]發現水楊酸處理誘導了采后甜瓜果實ASA和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量的增加，從而抑制了丙二醛（MDA）的產生，清除過量的過氧化氫，有效防止了細胞膜脂過氧化。林藝芬[52]在用外源H2O2處理采后龍眼的研究中發現，H2O2促進果實果皮中抗氧化物質ASA、GSH、類黃酮與類胡蘿卜素的降解，加速了采后O2-·產生速率和MDA 含量的上升，促進了ROS 的氧化爆發，最終導致果實和果皮褐變。胡花麗等[53]研究發現延緩獼猴桃的衰老機理與其維持果實較高的ASA 和GSH 有關，2%O2＋3%CO2氣調處理有利于提高果實的ASA 和GSH 含量，清除O2-·產生速率和DPPH 自由基，有利于再建果實氧化還原的穩態，從而延緩獼猴桃的衰老進程。

3 保鮮技術對果蔬采后ROS 清除的影響

根據果蔬氧化還原防御系統的要求，只要能夠清除果蔬ROS 或提升酶促或非酶促抗氧化體系，均能夠減少采后果蔬的品質劣變，延長貯藏保鮮時間。近年來，國內外開發了許多安全且具有干預果蔬氧化還原防御系統功能的保鮮技術。如采用酸性氧化電位水對藍莓進行處理后，能夠調節ROS 代謝并減少其積累，提高SOD、CAT 和APX 的活性，從而降低果實腐爛率[54]。納米復合包裝材料也能減少ROS 的產生，抑制金針菇的呼吸作用和失重率、保持其貨架品質[55]。臭氧（O3）已被證明在農產品儲存方面發揮了積極的作用，能夠降低O2-·和H2O2的含量，提高SOD、CAT、APX 及單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）的活性，促進ASA 和GSH 的積累，改變相關抗氧化基因和蛋白的表達[56-57]。此外，外源ROS 清除劑、植物提取物和冰溫貯藏等保鮮方法也能較好地減少ROS 的積累，改善果蔬的貯藏品質并延長貯藏時間。

4 結論與展望

果蔬的成熟和衰老過程與活性氧的積累有關，也與其體內許多重要的酶促和非酶促抗氧化體系有關。雖然這些體系可以使果蔬在成熟衰老初期保持氧化還原處于動態平衡狀態，但在成熟衰老的代謝和結構分解過程中，果蔬仍會發生不可逆的氧化應激反應。因此，抗氧化化合物含量和抗氧化酶活性對延長果蔬貯藏期具有重要作用，對它們的調控研究已經成為國內外果蔬采后的重點和熱點。近年來，通過臭氧、包裝材料、天然植物提取物和冰溫貯藏等果蔬采后品質控制技術，能夠有效地控制活性氧的產生和積累，延緩果蔬的衰老變質，延長保鮮期和銷售期。

隨著分子生物學和檢測技術的發展和成熟，果蔬氧化還原防御系統的研究方向主要有以下幾點：通過進一步深入研究果蔬ROS 產生的機理及氧化還原防御系統的機制，從而開發出更多高效清除ROS、提高抗氧化活性的技術和方法；通過進一步探究果蔬不同處理對于觸發抗氧化機制的共同點，解析果蔬氧化還原系統激活的調控因素；通過進一步開展采后領域果蔬的活性氧代謝與其生理品質之間的相互作用關系研究，為采后果蔬保鮮新技術的開發提供理論參考；通過開展多學科交叉探究ROS 代謝與果蔬衰老之間的關系，如分子生物學在果蔬逆境脅迫與ROS 代謝機制方面的系統研究和應用，將對果蔬采后貯藏保鮮具有重要意義。