人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體對(duì)高糖環(huán)境下RPE細(xì)胞自噬和VEGF表達(dá)的影響

閆 瑾，王 莉，李 蓉，楊 揚(yáng)，劉文蘭，朱 丹，焦 聰

0引言

外泌體(exosomes)是一種具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外微囊泡，直徑范圍40～100nm[1]，攜帶脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸以及細(xì)胞因子等多種內(nèi)容物[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于多種組織中的一類(lèi)干細(xì)胞，具備多向分化潛能[3]，具有不易引起免疫反應(yīng)、易于獲得和可體外分離連續(xù)傳代培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)[4]。作為視網(wǎng)膜外屏障的組成部分，視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細(xì)胞具有多種復(fù)雜生理生化功能，其分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進(jìn)新生血管形成的關(guān)鍵因子[5-7]。自噬是真核細(xì)胞在生理和病理狀態(tài)下均存在的一種動(dòng)態(tài)的生理過(guò)程，通過(guò)溶酶體介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和衰老受損細(xì)胞器等大分子物質(zhì)的代謝和降解，利用自噬這一更新過(guò)程維持細(xì)胞的正常代謝內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[8]。既往研究顯示，在高糖、缺氧或炎癥等環(huán)境下，視網(wǎng)膜自噬水平明顯異常，進(jìn)而參與眼部疾病的發(fā)生和發(fā)展[9-12]。隨著MSCs外泌體與眼科疾病相關(guān)研究的開(kāi)展，發(fā)現(xiàn)MSCs外泌體在視神經(jīng)損傷、年齡相關(guān)性黃斑變性及角膜疾病的治療中表現(xiàn)出潛在的價(jià)值[13-17]。本研究以人RPE細(xì)胞作為研究對(duì)象，觀察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical mesenchymal stem cells, hUMSC)源外泌體對(duì)高糖環(huán)境下人RPE細(xì)胞的自噬和VEGF表達(dá)水平的影響，為糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療提供新的可能性。

1材料和方法

1.1材料經(jīng)產(chǎn)婦本人及家屬簽署臍帶用于實(shí)驗(yàn)研究的知情同意書(shū)及學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，取健康足月嬰兒臍帶。人ARPE-19株(武漢普諾賽生命科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；兔多抗自噬標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-related protein 1 light chain 3, LC3)B(Ab48394)、兔單抗CD90(ab133350)、兔單抗CD63(ab134045)(英國(guó)abcam公司)；兔多抗Beclin-1(3495S，美國(guó)CST公司)；兔多抗p62(AF5384，美國(guó)Affinity Biosciences公司)；兔多抗GAPDH(AB-P-R 001，杭州賢至生物有限公司)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(BA1054，武漢博士德生物工程有限公司)；外泌體提取試劑盒Total Exosome Isolation (from cell culture media)(4478359，美國(guó)Invitrogen公司)；噻唑蘭MTT(3580MG250，德國(guó)BIOFROX公司)；人VEGF ELISA試劑盒(Human VEGF-A ELISA Kit E-EL-H0111c武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司，型號(hào)ECLIPSE Ts2)；微型高速離心機(jī)(美國(guó)Labnet公司，型號(hào)C2500-R-230V)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo scientific公司，型號(hào)mμlISKANMK3)；透射電子顯微鏡(日本HITACHI公司，型號(hào)HT7700-SS)。

1.2方法

1.2.1 hUMSC的分離和培養(yǎng)及鑒定組織塊貼壁法分離培養(yǎng)hUMSC[18]。組織塊附著后添加含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，每隔3d換液，待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化傳代，比例為1∶3。hUMSC細(xì)胞傳代至第3代，胰酶消化離心后加入兔單抗CD90，4℃孵育后Western blot印跡檢測(cè)。

1.2.2 hUMSC外泌體的提取取第4～5代生長(zhǎng)良好的hUMSC細(xì)胞，用10%exo-FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞上清液，2000g離心30min以去除細(xì)胞、碎片等。將離心后獲得的上清液與外泌體提取試劑按2∶1混勻，4℃孵育過(guò)夜后10000g離心1h，保留沉淀，即為外泌體。加入PBS重懸外泌體，將重懸后的外泌體分裝保存于-80℃冰箱。

1.2.3外泌體鑒定及結(jié)構(gòu)觀察外泌體蛋白鑒定：蛋白樣品上樣，凝膠電泳至目的蛋白有效分離。轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h。將膜與一抗CD63(1∶1000)于4℃孵育過(guò)夜。將膜浸泡于HRP標(biāo)記二抗(1∶50000)中，37℃搖床孵育2h。ECL試劑盒顯影曝光，分析處理膠片中蛋白條帶的灰度值。外泌體結(jié)構(gòu)觀察：質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%多聚甲醛固定外泌體懸液，滴樣本于載樣銅網(wǎng)上，3%磷鎢酸染色5min，室溫干燥，透射電鏡觀察外泌體結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)及分組選用DMEM/F12(含10% FBS+1%青霉素和鏈霉素)培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第5～10代，按照5.0×105個(gè)/孔傳代于6孔板內(nèi)，隨機(jī)分為對(duì)照組、高糖組和外泌體+高糖組，對(duì)照組在無(wú)糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，高糖組在培養(yǎng)基中加入25mmol/L D-glucose，外泌體+高糖組先用75μg/mL外泌體預(yù)處理12h后，置于含25mmol/L D-glucose的培養(yǎng)基中，三組培養(yǎng)時(shí)間均為48h。

1.2.5 MTT法檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞增殖率使用微量酶比色法測(cè)定試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均OD值-空白孔平均OD值)/(對(duì)照組平均OD值-空白孔平均OD值)×100%。

1.2.6透射電子顯微鏡下觀察自噬體的形成刮取各組細(xì)胞，戊二醛固定2h，充分漂洗后，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鋨酸中4℃固定，脫水，包埋。在裸銅網(wǎng)格上制備超薄切片，鈾鉛雙染色，透射電子顯微鏡下觀察自噬體形態(tài)、結(jié)構(gòu)及數(shù)量，拍照。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)各組ARPE-19細(xì)胞中自噬蛋白LC3B、Beclin-1和p62的表達(dá)收集各組細(xì)胞裂解充分后，離心提取總蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，滴加一抗，一抗稀釋濃度如下：LC3B(1∶1000)、Beclin-1(1∶1000)、p62(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶50000)孵育。暗室顯影，依據(jù)膠片灰度值，與內(nèi)參GAPDH比較計(jì)算出LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值及Beclin-1和p62蛋白相對(duì)表達(dá)量，每組3次生物學(xué)重復(fù)，取平均值。

1.2.8 ELISA法檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)按照使用說(shuō)明，采用人VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)ARPE-19細(xì)胞上清液中VEGF蛋白濃度。酶標(biāo)儀測(cè)量OD450值。應(yīng)用直線相關(guān)回歸分析，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)樣本對(duì)應(yīng)的VEGF濃度。

2結(jié)果

2.1 hUMSC的形態(tài)觀察及鑒定使用倒置顯微鏡觀察臍帶華通氏膠組織(Wharton jelly)貼壁培養(yǎng)的第3代hUMSC細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或紡錘形，形態(tài)均一，緊密排列，類(lèi)似纖維細(xì)胞，集落生長(zhǎng)，細(xì)胞分布呈魚(yú)群狀或漩渦狀(圖1A)。Western blot檢測(cè)hUMSC陽(yáng)性表達(dá)CD90(圖1B)，符合MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 hUMSC的形態(tài)觀察及鑒定 A：光學(xué)顯微鏡觀察第3代hUMSC形態(tài)(×100)。hUMSC細(xì)胞培養(yǎng)至第3代，呈成纖維細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形，渦旋狀排列;B:Western blot檢測(cè)hUMSC表面標(biāo)志蛋白CD90。

2.2 hUMSC外泌體超微結(jié)構(gòu)觀察及鑒定經(jīng)透射電鏡觀察可見(jiàn)分離純化后的外泌體為內(nèi)含低電子密度成分的球狀或橢球狀膜性囊泡，直徑范圍30～100nm。外泌體囊泡外圍可見(jiàn)類(lèi)質(zhì)脂膜性結(jié)構(gòu)(圖2A)。蛋白免疫印跡法顯示，hUMSC外泌體陽(yáng)性表達(dá)特異性標(biāo)志蛋白CD63(圖2B)。

圖2 hUMSC外泌體形態(tài)及鑒定 A：透射電可見(jiàn)hUMSC外泌體為球狀或橢球狀膜性囊泡，直徑約30～100nm；B：Western blot檢測(cè)hUMSC外泌體表面標(biāo)志蛋白CD63。

2.3細(xì)胞中自噬體超微結(jié)構(gòu)的觀察透射電子顯微鏡下可見(jiàn)典型的自噬體為包裹了蛋白質(zhì)及細(xì)胞器等吞噬物的小囊泡，具備雙層膜結(jié)構(gòu)。電鏡檢查顯著反映了高糖環(huán)境及hUMSC外泌體對(duì)ARPE-19細(xì)胞自噬活性的影響，對(duì)照組細(xì)胞中僅見(jiàn)少量自噬體，高糖組及外泌體+高糖組細(xì)胞中自噬體數(shù)量明顯增多，而外泌體+高糖組細(xì)胞中自噬體數(shù)量較高糖組減少(圖3)。

圖3 透射電子顯微鏡下觀察各組ARPE-19細(xì)胞內(nèi)自噬體形成 A:對(duì)照組;B高糖組;C:外泌體+高糖組。

2.4 hUMSC外泌體對(duì)高糖條件下ARPE-19細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，各組ARPE-19細(xì)胞增殖率的總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。與對(duì)照組相比，高糖組和外泌體+高糖組細(xì)胞增殖率降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，外泌體+高糖組細(xì)胞增殖率高于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 hUMSC外泌體對(duì)高糖條件下ARPE-19細(xì)胞增殖、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p62蛋白相對(duì)表達(dá)量及VEGF的影響

2.5 hUMSC外泌體對(duì)ARPE-19細(xì)胞在高糖條件下LC3B-Ⅱ/Ⅰ值和Beclin-1及p62蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，高糖組ARPE-19細(xì)胞的LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin-1蛋白條帶明顯增強(qiáng)，p62蛋白表達(dá)降低，自噬活性較對(duì)照組明顯升高。加入hUMSC外泌體預(yù)處理后，LC3B-Ⅱ/Ⅰ值及Beclin-1的蛋白表達(dá)減弱，p62的表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖4)。

圖4 各組細(xì)胞中LC3B、Beclin-1和p62蛋白電泳圖 A:對(duì)照組;B高糖組;C:外泌體+高糖組。

對(duì)照組、高糖組、外泌體+高糖組ARPE-19細(xì)胞的LC3B-Ⅱ/Ⅰ值、Beclin-1和p62的相對(duì)蛋白表達(dá)量的組間總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表1)。組間比較顯示，對(duì)照組和外泌體+高糖組細(xì)胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ值和Beclin-1的相對(duì)蛋白表達(dá)相較于高糖組顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，外泌體+高糖組的LC3B-Ⅱ/Ⅰ值與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.055)，外泌體+高糖組Beclin-1的相對(duì)蛋白表達(dá)相較于對(duì)照組有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)照組和外泌體+高糖組細(xì)胞中p62的相對(duì)蛋白表達(dá)相較于高糖組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，外泌體+高糖組中p62的相對(duì)蛋白表達(dá)相較于對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.6 hUMSC外泌體對(duì)高糖條件下ARPE-19細(xì)胞上清液中VEGF蛋白表達(dá)量的影響酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)顯示，對(duì)照組、高糖組、外泌體+高糖組ARPE-19細(xì)胞上清液中VEGF的質(zhì)量濃度的整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)。相較于對(duì)照組和外泌體+高糖組，高糖組VEGF的質(zhì)量濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，外泌體+高糖組細(xì)胞VEGF質(zhì)量濃度低于高糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3討論

絕大部分細(xì)胞都會(huì)向細(xì)胞外環(huán)境中釋放外泌體，外泌體在遠(yuǎn)距離細(xì)胞間的相互作用中發(fā)揮了重要作用，是細(xì)胞間相互交流的一種媒介，蛋白質(zhì)是外泌體攜帶的常見(jiàn)成分，因此可以作為特異性標(biāo)記物，在外泌體提取過(guò)程中用于鑒定和定量[19-20]。hUMSC有促進(jìn)組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制炎癥等作用[21]。既往多項(xiàng)研究表明MSCs外泌體的功能和活性與其親代細(xì)胞相似，與間充質(zhì)干細(xì)胞相比，MSCs外泌體體積小、無(wú)免疫原性而且更加穩(wěn)定，具有治療多種疾病的潛能[1]。本研究利用外泌體分離提取試劑盒成功提取了hUMSC外泌體，并通過(guò)透射電鏡觀察其形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，鑒定了外泌體特異性標(biāo)志物CD63，多種方法驗(yàn)證了外泌體提取結(jié)果的可靠性。

RPE層位于視網(wǎng)膜的最外層，為單層色素細(xì)胞，主要功能包括：維持光感受器的新陳代謝、吸收光線、抗氧化、為視網(wǎng)膜外層提供營(yíng)養(yǎng)、參與視覺(jué)循環(huán)和分泌細(xì)胞因子等，對(duì)維持視網(wǎng)膜光感受器微環(huán)境有重要作用。長(zhǎng)期處于高血糖環(huán)境會(huì)誘發(fā)RPE細(xì)胞出現(xiàn)缺血、氧化應(yīng)激、炎癥激活等病理改變，影響其結(jié)構(gòu)和功能[5]。He等[1]模擬年齡相關(guān)性黃斑變性，將hUMSC外泌體與藍(lán)光損傷RPE細(xì)胞共培養(yǎng)，并向激光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷小鼠玻璃體腔內(nèi)注射不同劑量外泌體，發(fā)現(xiàn)hUMSC外泌體顯著降低VEGF-A表達(dá)，修復(fù)藍(lán)光損傷視網(wǎng)膜，保護(hù)RPE細(xì)胞。本研究通過(guò)體外模擬高糖狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)高糖處理48h可以造成RPE細(xì)胞損傷，明顯降低其增殖率，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降。hUMSC外泌體干預(yù)可使細(xì)胞的增值率升高，對(duì)高糖環(huán)境下的RPE細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用。

自噬存在于生理狀態(tài)下的細(xì)胞中，自噬水平維持在一定范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的代謝、增殖、生長(zhǎng)、分化、修復(fù)以及活性的維持都起到重要作用[8，22]。在自噬這一動(dòng)態(tài)過(guò)程的不同階段中，相關(guān)特異性基因編碼的LC3，Beclin-1和p62等20多種蛋白相互協(xié)同作用。LC3在主導(dǎo)自噬小體的雙膜延伸過(guò)程時(shí)，胞漿中的LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)生成位于自噬小體膜上的脂質(zhì)型LC3-Ⅱ，可以通過(guò)檢測(cè)LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ的轉(zhuǎn)化比例評(píng)估自噬的水平[23]，LC3存在多種不同類(lèi)型，目前自噬的蛋白標(biāo)記物常選用LC3B。絕大多數(shù)自噬相關(guān)蛋白在參與自噬小體的形成中均需要Beclin-1輔助[24]，因此Beclin-1蛋白表達(dá)量也是檢測(cè)自噬水平的常用標(biāo)記物。p62是自噬溶酶體膜相關(guān)標(biāo)記蛋白，其表達(dá)與自噬水平負(fù)相關(guān)，在自噬過(guò)程中主要介導(dǎo)底物識(shí)別，因此當(dāng)自噬反應(yīng)激活清除細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)時(shí)會(huì)被優(yōu)先降解，從而導(dǎo)致其表達(dá)水平降低[25]。本研究采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)LC3B的切割情況、Beclin-1的蛋白相對(duì)表達(dá)量及p62的降解程度，三項(xiàng)結(jié)果共同檢測(cè)RPE細(xì)胞的自噬水平。目前認(rèn)為檢測(cè)自噬情況的金標(biāo)準(zhǔn)是電子顯微鏡觀察到自噬小體的特征性雙層膜結(jié)構(gòu)[23]，但在自噬發(fā)生的不同動(dòng)態(tài)階段中，會(huì)產(chǎn)生與自噬小體形態(tài)類(lèi)似的自噬溶酶體和自噬內(nèi)涵體，在未做特殊標(biāo)記的情況下，很難準(zhǔn)確區(qū)分這些結(jié)構(gòu)。此外在不同切面的切片中觀察到的自噬小體數(shù)量差別較大，會(huì)導(dǎo)致電鏡檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生誤差。因此本文根據(jù)自噬標(biāo)志性蛋白檢測(cè)和電鏡觀察兩種結(jié)果，綜合分析細(xì)胞內(nèi)的自噬水平，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。已有的研究結(jié)果顯示，高糖條件會(huì)上調(diào)視網(wǎng)膜自噬水平，進(jìn)而誘導(dǎo)DR的發(fā)生[12]。Lopes等[11]在體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞,并檢測(cè)p62蛋白的降解情況，發(fā)現(xiàn)高糖會(huì)增強(qiáng)Müller細(xì)胞的自噬反應(yīng)，誘導(dǎo)其大量釋放VEGF。本研究證實(shí)，高糖環(huán)境下RPE細(xì)胞的自噬被激活，表現(xiàn)為自噬體增加，LC3B-Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1蛋白表達(dá)增加，而p62表達(dá)下降。用75μg/mLhUMSC外泌體預(yù)處理后，自噬體減少，細(xì)胞表達(dá)LC3B-Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1蛋白下降，p62水平增加。

視網(wǎng)膜新生血管是糖尿病視網(wǎng)膜病變晚期的典型病理性改變，在參與糖尿病新生血管生成的眾多細(xì)胞因子中，VEGF是其中具有高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞促有絲分裂素，可以破壞血-視網(wǎng)膜屏障，引起組織缺氧、毛細(xì)血管閉塞及微血栓形成，導(dǎo)致滲出、出血以及水腫。還可以增加血管通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，誘導(dǎo)血管生成[6-7]。同時(shí)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞在高糖環(huán)境誘導(dǎo)下VEGF受體增多、與VEGF親和力增強(qiáng)，進(jìn)一步提高了VEGF與受體的結(jié)合率，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[26]。我們的研究結(jié)果顯示，高糖會(huì)導(dǎo)致REP細(xì)胞表達(dá)VEGF明顯增加，hUMSC外泌體有效降低VEGF水平，與既往研究結(jié)果一致[1]。

綜上所述，本研究提示高糖環(huán)境下RPE細(xì)胞自噬被激活，hUMSC外泌體可有效抑制高糖環(huán)境下ARPE-19細(xì)胞自噬水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并下調(diào)VEGF的表達(dá)，對(duì)RPE細(xì)胞起到保護(hù)作用。本研究為外泌體的應(yīng)用提供了新的思路，外泌體作為能在細(xì)胞間起到調(diào)控作用的囊泡結(jié)構(gòu)，可能在糖尿病視網(wǎng)膜病變治療中起到重要作用。但目前所有的外泌體提取方法均有不足之處，獲得的外泌體中包含不同的干擾成分，造成提取物不同質(zhì)問(wèn)題[27]。hUMSC外泌體在體內(nèi)對(duì)自噬水平的影響及安全性還需通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)明確。另外，hUMSC外泌體在抑制高糖環(huán)境下ARPE-19細(xì)胞自噬，下調(diào)VEGF表達(dá)的過(guò)程中，發(fā)揮作用的具體成分，通過(guò)的機(jī)制及激活的信號(hào)通路均需要進(jìn)一步更深入的研究和驗(yàn)證。