基于二氧化錳納米片和核酸外切酶I構(gòu)建熒光適配體傳感器檢測(cè)氯霉素

馬鵬飛 齊 碩 呂 艷 周 游 王周平

(1. 江南大學(xué)食品國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌均有抑制作用，曾被廣泛地應(yīng)用于感染性疾病治療[1-3]。然而氯霉素對(duì)人體有很大的毒副作用，可抑制人體骨髓造血功能從而引起再生性障礙性貧血癥等[4-5]。根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號(hào)公告，氯霉素禁止在食品和動(dòng)物飼料中使用。由于氯霉素低廉的成本和優(yōu)異的抑菌效果，目前仍然有一些氯霉素在蜂蜜、牛奶和水產(chǎn)品中違法使用的報(bào)道。因此，為了保障公眾健康，需要建立一種準(zhǔn)確靈敏的氯霉素檢測(cè)方法。目前廣泛使用的氯霉素檢測(cè)方法有液相色譜—質(zhì)譜法[6]、酶聯(lián)免疫法[7]、超高效液相色譜法[8]等，但是這些方法需要專業(yè)和經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員，儀器價(jià)格昂貴且檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)。近年來(lái)，科研人員報(bào)道了一些基于納米材料和核酸適配體的新型氯霉素檢測(cè)方法，包括電化學(xué)法[9]、熒光法[10]和比色法[11]等，為氯霉素的檢測(cè)提供了新思路。

適配體(Aptamer)是通過(guò)指數(shù)富集配體進(jìn)化(SELEX)技術(shù)篩選得到，長(zhǎng)度在10～100個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的單鏈DNA或RNA。適配體能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、氫鍵和疏水相互作用等與生物小分子、金屬離子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞以及細(xì)菌等高效的結(jié)合[12-14]。適配體與抗體相比，具有制備簡(jiǎn)單，易于功能化修飾，穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)[15-18]。適配體的這些優(yōu)點(diǎn)為研制應(yīng)用于食品安全檢測(cè)與控制中的傳感器提供了基礎(chǔ)。如趙旭等[19]研制了一種基于核酸適配體的鎘離子可視化檢測(cè)方法，檢測(cè)的線性范圍為0.1～5.0 ng/mL，檢測(cè)為0.5 ng/mL。許宙等[20]基于磁性納米材料，構(gòu)建了一種酶聯(lián)增敏適配體傳感器檢測(cè)雙酚A，檢測(cè)限低至0.5 pg/mL。

二氧化錳納米片(Manganese dioxide nanosheet，MnO2NS)是一種超薄的二維納米材料，具有優(yōu)良的熒光淬滅能力，在生物傳感，細(xì)胞成像和藥物輸送領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[21-23]，如Wang等[24]基于MnO2NS淬滅有機(jī)染料熒光原理，構(gòu)建了檢測(cè)microRNA的傳感平臺(tái)，檢測(cè)限為0.8 nmol/L。核酸外切酶I(Exonuclease I, Exo-I)能夠以3末端到5末端方向降解單鏈DNA，不依賴于特異的核苷酸序列，能夠有效地?cái)U(kuò)增信號(hào)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)。

研究擬利用MnO2NS對(duì)核酸適配體的熒光淬滅能力，以及Exo-I的酶促靶標(biāo)循環(huán)放大信號(hào)作用，構(gòu)建一種靈敏的氯霉素?zé)晒鈾z測(cè)新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白(BSA)、醋酸錳、氯化鈉和氯化鉀等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

FAM標(biāo)記的氯霉素適配體(5’-FAM-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG)、核酸外切酶I(Exo-I，20 U/μL)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

氯霉素、四環(huán)素、土霉素、卡那霉素和甲砜霉素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

全黑96孔微孔板：美國(guó)康寧公司；

氯霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒：百奧森食品安全科技有限公司；

超純水：18.2 MΩ，由Millipore凈水系統(tǒng)制備。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀：BioTek SynergyH1型，美國(guó)BioTek 公司；

透射電鏡：JEM-2100型，日本電子株式會(huì)社；

原子力顯微鏡：Dimension ICON型，德國(guó)布魯克科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MnO2NS的制備 二氧化錳的合成參照Han等[25]的方法并作改進(jìn)。取1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的BSA和1 mL質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的醋酸錳置于250 mL的燒杯中，并向燒杯中加入98 mL超純水至燒杯內(nèi)溶液總體積為100 mL；將燒杯置于磁力攪拌器上，常溫?cái)嚢杈鶆颍?0 min后，向溶液中加入濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液，將溶液的pH值調(diào)節(jié)到8.0；將溶液置于磁力攪拌器上繼續(xù)攪拌6 h，得到淺黃色的溶液，溶液經(jīng)離心沉淀后，所得材料沉淀用超純水清洗兩次，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測(cè)體系的構(gòu)建 將適配體原液(1 μmol/L)在95 ℃ 加熱5 min后，置于室溫靜置30 min，使適配體形成穩(wěn)定的空間構(gòu)象。在1.5 mL的離心管中加入10 μL的適配體原液和10 μL的MnO2NS原液(1 mg/mL)，加入180 μL氯霉素結(jié)合緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，5 mmol/L MgCl2，pH 7.4)使得溶液總體積為200 μL。為了使適配體完全被MnO2NS吸附，適配體與MnO2NS在室溫避光條件下，孵育30 min。將5 μL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品加入到離心管中，同時(shí)加入4 μL的Exo-I，37 ℃下避光孵育50 min。最后將100 μL反應(yīng)液體加入酶標(biāo)板中，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)528 nm。

1.2.3 MnO2NS質(zhì)量濃度的優(yōu)化 MnO2NS的質(zhì)量濃度與適配體是否被完全吸附有關(guān)，如果溶液中有游離的適配體，會(huì)造成檢測(cè)的熒光背景信號(hào)高，影響檢測(cè)性能。在50 nmol/L適配體濃度下，加入不同體積的MnO2NS，使其終質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.30 mg/mL，測(cè)定體系熒光強(qiáng)度。

1.2.4 適配體濃度的優(yōu)化 固定Exo-I的用量和酶切時(shí)間不變，在5 nmol/L氯霉素濃度下，加入不同濃度的適配體，使其終濃度分別為5，10，20，50，100，150，200 nmol/L，測(cè)定體系熒光強(qiáng)度。

1.2.5 Exo-I用量的優(yōu)化 固定適配體濃度，MnO2NS質(zhì)量濃度和酶切時(shí)間不變，在5 nmol/L氯霉素濃度下，加入不同體積的Exo-I，使其在檢測(cè)體系中的用量分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 U/μL，測(cè)定體系熒光強(qiáng)度。

1.2.6 酶切時(shí)間的優(yōu)化 固定適配體濃度，MnO2NS質(zhì)量和Exo-I用量不變，在5 nmol/L氯霉素濃度下，酶切時(shí)間分別為10，30，50，70，90，110 min，測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.2.7 實(shí)際樣品檢測(cè) 從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買(mǎi)合格的蜂蜜，用氯霉素適配體結(jié)合緩沖液稀釋20倍之后，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾稀釋液體。將不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品加入濾液，用試驗(yàn)構(gòu)建的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算實(shí)際樣品檢測(cè)加標(biāo)回收率，并與商用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

如圖1所示，熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記的氯霉素適配體首先被MnO2NS吸附，基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移效應(yīng)，適配體標(biāo)記的熒光被淬滅。當(dāng)溶液中無(wú)氯霉素時(shí)，即使加入Exo-I，由于MnO2NS會(huì)阻礙酶切，Exo-I無(wú)法剪切被二氧化錳吸附的適配體，溶液無(wú)熒光恢復(fù)。當(dāng)溶液中存在氯霉素時(shí)，適配體特異性地與氯霉素結(jié)合后，從MnO2NS表面解離，溶液熒光恢復(fù)；在有Exo-I存在的條件下，Exo-I剪切溶液中與氯霉素結(jié)合而脫離MnO2NS的適配體。適配體由于被剪切，失去了結(jié)構(gòu)的完整性進(jìn)而無(wú)法與氯霉素結(jié)合，釋放出來(lái)的氯霉素會(huì)再次與被MnO2NS吸附的適配體結(jié)合，使適配體從MnO2NS表面解離，溶液進(jìn)一步恢復(fù)熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)氯霉素的檢測(cè)。

圖1 氯霉素檢測(cè)原理圖

2.2 二氧化錳納米片的表征

圖2為MnO2NS的表征圖。由圖2(a)可知，制備的MnO2NS呈薄片狀結(jié)構(gòu)，具有較大的比表面積；由圖2(b)和圖2(c)可知，制備的MnO2NS厚度大約為1.2 nm，是單層MnO2NS。

2.3 試驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1 MnO2NS質(zhì)量濃度的優(yōu)化 由圖3可知，隨著MnO2NS質(zhì)量濃度的增加，溶液的熒光值減小，當(dāng)MnO2NS 質(zhì)量濃度≥0.05 mg/mL時(shí)，溶液中適配體的熒光被完全淬滅，表明適配體完全被MnO2NS吸附，無(wú)游離的，因此選擇0.05 mg/mL為MnO2NS的最佳質(zhì)量濃度。

2.3.2 適配體濃度的優(yōu)化 由圖4可知，隨著適配體濃度的增加，溶液的熒光值增加，當(dāng)適配體的濃度≥50 nmol/L 時(shí)，溶液的熒光值基本達(dá)到飽和，說(shuō)明此時(shí)適配體的量已經(jīng)達(dá)到飽和，同時(shí)為了節(jié)約適配體的使用量，增加檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)性，選擇50 nmol/L為適配體的最佳濃度。

圖2 二氧化錳納米片表征圖

2.3.3 Exo-I用量的優(yōu)化 由圖5可知，隨著Exo-I用量的增加，更多的適配體從MnO2NS解離，溶液熒光強(qiáng)度增大，當(dāng)酶在檢測(cè)體系中的用量≥0.4 U/μL時(shí)，溶液熒光強(qiáng)度基本保持不變，說(shuō)明體系中酶的用量達(dá)到飽和，選擇0.4 U/μL作為Exo-I的最佳用量。

圖3 二氧化錳納米片質(zhì)量濃度的優(yōu)化

2.3.4 酶切時(shí)間的優(yōu)化 由圖6可知，隨著酶切時(shí)間的增加，溶液熒光強(qiáng)度迅速增大，當(dāng)酶切時(shí)間≥40 min時(shí)，溶液的熒光值趨于平穩(wěn)，說(shuō)明酶切達(dá)到飽和；若酶切不充分，體系熒光弱，將影響檢測(cè)性能；而酶切時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，將影響檢測(cè)效率，因此選擇50 min作為最佳酶切時(shí)間。

2.4 線性范圍與檢測(cè)限

在最佳的試驗(yàn)條件下，利用構(gòu)建的檢測(cè)方法，對(duì)不同濃度的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，由圖7可知，氯霉素的濃度為0.1～80.0 nmol/L時(shí)，氯霉素濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線性，校正曲線方程為y=856lgx+1 459(R2=0.995)，檢出限為0.08 nmol/L(S/N=3)。

圖4 適配體濃度的優(yōu)化

圖5 核酸外切酶I用量的優(yōu)化

圖6 酶切時(shí)間的優(yōu)化

2.5 特異性

為了驗(yàn)證檢測(cè)方法的特異性，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下，選擇甲砜霉素、四環(huán)素、土霉素、卡那霉素進(jìn)行分析檢測(cè)，濃度均為1 nmol/L。由圖8可知，氯霉素與其他抗生素的熒光強(qiáng)度差距明顯，表明該適配體傳感器具有良好的特異性。

2.6 實(shí)際樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

為了驗(yàn)證所構(gòu)建的適配體傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中的準(zhǔn)確性，用蜂蜜樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，并將檢測(cè)結(jié)果與酶聯(lián)免疫法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，加標(biāo)試驗(yàn)回收率為92%～99%，酶聯(lián)免疫法的回收率為91%～103%，表明方法具有良好的準(zhǔn)確性，可用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

圖7 熒光強(qiáng)度與氯霉素的線性關(guān)系

圖8 特異性分析

表1 氯霉素加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

研究構(gòu)建了一種基于MnO2NS和Exo-I酶切擴(kuò)增的方法檢測(cè)氯霉素，在最優(yōu)條件下，檢測(cè)限達(dá)0.08 nmol/L。檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，特異性好，靈敏度高，在實(shí)際樣品檢測(cè)中加標(biāo)回收率與商用酶聯(lián)免疫試劑盒保持一致，具有較強(qiáng)的實(shí)用性，但酶的活性會(huì)受到溫度的影響，后續(xù)研究可通過(guò)加入一定量的多糖等增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。