貯藏條件對核桃仁蛋白質品質的影響

彭 武 王煒清 王 萍 余雄偉 付琴利 李述剛

(1. 合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009；2. 湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；3. 塔里木大學，新疆 阿拉爾 843300；4. 武漢旭東食品有限公司，湖北 武漢 430000)

2018年世界核桃總產量為3 662 507 t，中國的核桃總產量為1 586 367 t[1]，約占世界核桃總產量的1/2。核桃仁中富含維生素、礦物質、蛋白質以及脂質，其中約70%的脂質為不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸、亞麻酸等[2-5]。食品加工中，由于核桃仁富含營養物質一直被作為功能性成分添加到食品中，如肉類、乳制品和烘焙類食品的加工等[6]。

核桃仁蛋白質含18種人體所需的各種必需氨基酸，是一種營養均衡的重要植物蛋白質資源，其由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白等組成[7]。在貯藏過程中核桃仁蛋白易受到環境條件(如溫度、光照、氧氣含量等)的影響而造成其品質下降，姜莉等[8]研究發現，溫度對核桃仁蛋白的溶解性影響顯著，當溫度為55 ℃時其溶解性達到最大；曹燦等[9]研究發現核桃蛋白在其等電點時乳化性最小而在堿性環境中其乳化性較好。

試驗擬以核桃仁為研究對象，通過圓二色光譜和MALDI-TOF-MS等技術分析其貯藏過程中蛋白質理化組成、結構特性和消化產物變化規律，旨在揭示貯藏條件對核桃仁蛋白質營養與功能影響，為其貯藏保鮮與開發利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃：溫185，新疆阿克蘇地區；

5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽(DTNB)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)：優級純，美國Sigma公司；

二硫蘇糖醇(DTT)：分析純，Aladdin阿拉丁試劑公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

試驗用水均為去離子水；

雙光束紫外可見分光光度計：TU-1900型，北京普析通用儀器有限責任公司；

熒光分光光度計：F-4600型，日立高新技術(上海)國際貿易有限公司；

圓二色光譜儀：J-1500型，日本Jasco公司；

傅里葉紅外變換光譜儀：Nexus470型，美國Mettler公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 核桃仁去殼烘干后分為真空包裝和非真空包裝兩種包裝方式，分別于(4.0±0.1)，(35.0±0.1)，(25.0±0.1) ℃ 3種溫度下保存9個月，貯藏期間提取核桃仁蛋白進行各項指標的測定。

1.2.2 核桃仁蛋白的提取 參照Liu等[10]的方法略修改。通過石油醚脫脂并用體積分數95%乙醇洗滌得到脫脂核桃粉。將得到的脫脂核桃粉溶解于去離子水[m核桃粉∶V去離子水=1∶20 (g/mL)]中，用1 mol/L NaOH溶液調pH至11.0。30 ℃下攪拌3 h，于4 ℃、10 000 r/min離心15 min。取上清液，用1 mol/L HCl溶液調pH至4.5，4 ℃、10 000 r/min離心15 min。用1 mol/L NaOH溶液將沉淀pH調至7.0，4 ℃透析3 d去除雜質和多余試劑，冷凍干燥得到蛋白粉。

1.2.3 SDS-PAGE電泳 將核桃仁蛋白溶液(1 mg/mL)與樣品緩沖液以V核桃仁蛋白∶V緩沖液=1∶1混合。選擇4%的積層凝膠和12%的分離凝膠進行電泳。樣品進入分離凝膠后，先于70 V下電泳約30 min，然后于100 V下電泳[11]。

1.2.4 二硫鍵和游離巰基含量測定

(1) 巰基含量：參照Zhao等[12]的方法并略改。取核桃仁蛋白粉0.1 g加入30 mL去離子水，磁力攪拌2 h后轉移至50 mL容量瓶中定容。移取1 mL蛋白溶液(2 mg/mL)溶解于包含有5 mL尿素溶液(8 mol/L、pH 8.0)的Tris-甘氨酸緩沖液和0.04 mL DTNB溶液(4 mg/mL)中。25 ℃反應1 h，測定412 nm處吸光度。按式(1)計算游離巰基含量。

(1)

式中：

CSH——游離巰基含量，μmol/g；

A412 nm——蛋白質在412 nm處吸光度；

C——樣品質量濃度，mg/mL；

D——稀釋因子。

(2) 二硫鍵含量：取3.0 mL包含有10 mmol/L DTT的尿素溶液(8 mol/L)與1.0 mL的蛋白質溶液(2 mg/mL)混勻，25 ℃反應1 h。添加6 mL體積分數為12%的三氯乙酸(TCA)反應1 h，將得到的蛋白質懸液于4 ℃、10 000 r/min離心10 min。將沉淀加入到9 mL尿素(8 mol/L)溶液和0.09 mL DTNB溶液中。混勻，測定412 nm處吸光度。按式(2)計算二硫鍵含量。

(2)

式中：

CSS——二硫鍵含量，μmol/g；

CSHT——總巰基含量(包括游離SH和還原的SS)，μmol/g；

CSHF——游離巰基含量，μmol/g。

1.2.5 羰基化合物含量測定 參照Shi等[13]的方法并略改。將1 mL蛋白溶液(2 mg/mL)加入到溶有1 mL DNPH溶液(10 mmol/L)的2 mol/L HCl中，室溫黑暗條件下攪拌1 h。加入3 mL 20%的TCA用來沉淀蛋白質。用1 mL乙醇和乙酸乙酯(V乙醇∶V乙酸乙酯為1∶1)混合物洗滌沉淀物3次，于3 mL鹽酸胍(6 mol/L)中37 ℃下溶解20 min。用不含蛋白的溶液作為空白對照組，測定370 nm 處吸光度，按式(3)計算羰基化合物的濃度。

(3)

式中：

CC——羰基含量，μmol/g；

A370 nm——樣品在370 nm處吸光度；

D——稀釋因子；

C——蛋白質濃度，mg/mL；

ε370 nm——DNPH的摩爾消光系數，22 000。

1.2.6 圓二色光譜 用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)將蛋白質溶液配置為0.2 mg/mL溶液，掃描范圍為190～250 nm。

1.2.7 蛋白質溶解度的測定 參照Qu等[14]的方法并略修改。樣品溶液(10 mg/mL)于室溫下攪拌2 h，8 000 r/min 離心20 min，按式(4)計算上清液蛋白濃度。

(4)

式中：

S——蛋白質溶解度，%；

C1——上清液中蛋白質含量，mg/mL；

C2——樣品中蛋白質含量，mg/mL。

1.2.8 表面疏水性(Ho)的測定 參照Hou等[15]的ANS探針法并略修改。將質量濃度為1 mg/mL的核桃仁蛋白溶液分別稀釋至0.001 25，0.002 50，0.005 00，0.010 00，0.020 00 mg/mL。取20 μL ANS溶液(8 mmol/L)加入到4 mL蛋白溶液中混勻。激發波長390 nm，發射波長470 nm，激發和發射狹縫寬度均為2.5 nm。以熒光強度為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標作圖，其斜率即為表面疏水性。

1.2.9 體外消化 參照Orsini等[16]的方法并修改。采用胃蛋白酶對核桃仁蛋白進行消化分解，m胃蛋白酶∶m蛋白質為1∶10，將反應體系的pH調至2.0，37 ℃水浴2 h，加入0.1 mol/L的碳酸鈉溶液滅酶，6 000 r/min離心20 min，上清液于4 ℃貯藏。

(1) 水解度(DH)的測定：參照Chang等[17]的方法并修改。配制40 mg/mL的鄰苯二醛(OPA)試劑(溶于甲醇)，依次加入十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液2.5 mL、四硼酸鈉溶液25 mL、巰基乙醇100 μL，加入去離子水定量至50 mL。取200 μL核桃仁蛋白溶液加入至4 mL OPA試劑中，35 ℃反應2 min，測定340 nm處吸光度，按式(5)計算水解度。

(5)

式中：

DH——水解度，%；

At——水解樣品的吸光度；

A0——原樣品的吸光度；

M——核桃仁蛋白的平均分子量；

ε——摩爾消光系數，6 000 (mol·cm)-1；

c——樣品濃度；

N——每個蛋白質分子的平均肽鍵數。

(2) MALDI-TOF-MS分析：利用MALDI-TOF-MS對體外消化產物上清液進行分析，肽質量指紋圖譜參數設置：紫外波長355 nm；加速度電壓20 000 V；最佳質量分辨率1 500 Da；重復頻率200 Hz；采集60～7 000 Da的信號。

1.2.10 數據處理及分析 所有試驗重復3次，使用SPSS 16.0軟件進行統計分析。結果以均數±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蛋白質分子量分布

由圖1可知，核桃仁蛋白分子量主要分布在35～70，10～15 kDa；且隨著貯藏時間的延長，分子量位于10～15 kDa 處的蛋白波段逐漸變淺，140 kDa處的波段逐漸加深，表明隨著貯藏時間的增加，核桃仁蛋白分子聚集度加大；同時，與非真空條件相比，核桃仁蛋白在真空條件下聚集程度較低，兩種真空條件下，4 ℃的聚集程度均低于25 ℃和35 ℃的。這可能是由于核桃仁蛋白分子在貯藏過程中結構被破壞，蛋白質內部二硫鍵含量發生變化以及表面電荷的改變使得小分子肽之間發生聚集，造成蛋白質聚集度上升，而在真空或者冷藏條件下蛋白質結構被破壞的程度較低。

2.2 二硫鍵、游離巰基及羰基化合物含量變化

蛋白質游離巰基和二硫鍵含量的變化與蛋白質中的活性基團特別是半胱氨酸殘基密切相關，二硫鍵含量越高，蛋白質結構更緊密，其表面活性越差。由圖2(a)、圖2(b) 可知，隨著貯藏時間的延長，核桃仁蛋白的游離巰基含量顯著降低，從38.77 mol/g下降至8.55 mol/g，而二硫鍵含量從16.88 mol/g增加到36.40 mol/g；真空條件下核桃仁蛋白質的二硫鍵、游離巰基含量的下降趨勢緩于非真空條件；兩種真空條件下，4 ℃時游離巰基含量的下降趨勢最慢，表明核桃仁蛋白在貯藏過程中結構被破壞，暴露出了更多的活性基團(主要是疏水基團和半胱氨酸)，以及半胱氨酸和蛋氨酸殘基，其極易被氧化。而蛋白質中的游離巰基易受羥基自由基的影響，會被氧化轉化為分子內和分子間的二硫鍵[18]，導致二硫鍵含量上升，且真空和冷藏環境對于游離巰基的氧化具有抑制作用。

M. 蛋白質標品 1. 真空條件4 ℃ 2. 真空條件25 ℃ 3. 真空條件35 ℃ 4. 非真空條件4 ℃ 5. 非真空條件25 ℃ 6. 非真空條件35 ℃

蛋白質的羰基化是非酶促不可逆反應，會造成蛋白質結構的損壞，導致蛋白質失去其原有的溶解性、表面疏水性等功能特性。由圖2(c)可知，核桃仁蛋白質中羰基化合物含量隨貯藏時間的增加而增加；35 ℃非真空貯藏9個月后，核桃仁蛋白質的羰基含量從0.11 mol/g 顯著增加到12.91 mol/g (P<0.05)；4 ℃真空貯藏9個月后，羰基化合物含量變化最小。這可能是由于蛋白質的α-碳原子和氨基酸(賴氨酸、精氨酸、組氨酸、酪氨酸等)側鏈易受自由基、脂質過氧化或中間產物的氧化；同時肽鏈可以通過斷裂或與非蛋白成分結合形成羰基，使核桃仁蛋白質的羰基化合物含量在貯藏期間增大；而真空冷藏條件不利于羰基化合物的生成。

2.3 二級結構變化

由表1可知，隨著貯藏時間的增加，蛋白質的β-折疊和無規卷曲度上升，α-螺旋和β-轉角減少；真空條件下4 ℃ 時二級結構的變化趨勢最為緩慢，表明隨著貯藏時間的增加，核桃仁蛋白質的二級結構發生了變化，即蛋白質結構趨向于無序松散狀態，其穩定性逐漸降低；真空和冷藏環境對于蛋白質結構的變化具有減緩作用。

圖2 貯藏條件對游離巰基、二硫鍵及羰基化合物含量的影響

表1 貯藏條件對核桃仁蛋白質二級結構的影響

2.4 蛋白質功能特性

2.4.1 溶解性 由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，核桃仁蛋白質溶解度顯著降低(P<0.05)。非真空35 ℃時的溶解度降低得最多，貯藏9個月后蛋白質溶解度由25.63% 降低至3.27%；真空4 ℃時的溶解度降低得最少，貯藏9個月后溶解度由25.63%降低至14.55%。溶解度的降低可能與蛋白質表面電荷的變化引起疏水作用的增強有關[19-20]：① 聚集后的蛋白質表面電荷分布不均，親水性片段較少，限制了蛋白質與水之間相互作用的頻率，促進了蛋白質顆粒之間的聚集，最終降低了蛋白質的溶解性；② 由于蛋白質結構的破壞、疏水性基團的暴露進一步導致了蛋白質溶解度的降低，而真空和冷藏條件對于溶解度的降低具有阻礙作用。

2.4.2 表面疏水性 由圖4可知，核桃仁蛋白質的表面疏水性隨貯藏時間的增加而增加，其中非真空35 ℃下的表面疏水性增加得最多，從4 049.7增長至9 165.9；真空4 ℃下的表面疏水性增加得最低，由4 049.7增長至6 573.2。這可能是由于貯藏過程中蛋白質結構發生改變，將原本存在于內部的疏水性基團暴露在蛋白質表面從而增加了蛋白質的表面疏水性[21]；且真空和冷藏條件對于表面疏水性的上升具有阻礙作用。

2.4.3 體外消化特性

(1) 水解度：由圖5可知，真空4 ℃時的水解度略有下降，而非真空35 ℃時的水解度下降最為顯著，從47.28% 下降至36.15%；說明較高的溫度及非真空條件使得水解度的降低更為明顯。水解度的下降可能是由于蛋白質分子的聚集，較高的溫度和非真空環境會促進蛋白質分子聚集，降低胃蛋白酶作用位點，抑制胃蛋白酶活性[22]；此外蛋白質二級結構的改變也會導致蛋白質消化程度的改變，例如β-折疊的含量與蛋白質體外消化率呈負相關關系[23-24]。

圖3 貯藏條件對核桃仁蛋白質溶解度的影響

圖4 貯藏期間核桃仁蛋白質表面疏水性的變化

(2) 消化產物：由圖6可知，核桃仁蛋白質體外消化分解產物的初始階段肽段主要集中在1 000～2 000 Da，與4 ℃ 貯藏的樣品相比，非真空35 ℃下的低分子量肽分布較少，高分子量肽分布較多，肽段種類較豐富。這是由于核桃仁蛋白質分子隨貯藏時間的延長而發生交聯并產生聚集，掩蓋了胃蛋白酶的裂解位點，因此核桃仁蛋白質聚集物難以被胃蛋白酶降解成小肽段，故核桃仁蛋白質消化肽段的分子量逐漸增加。

(3) 維恩圖：由圖7可知，真空條件下核桃仁蛋白質消化后鑒定出的獨特多肽數分別為13 521，12 343，10 969，10 296；非真空條件下，獨特肽段分別為13 886，12 377，10 114，5 497。由于消化率越高，其消化產物中獨特的肽段越多。因此，貯藏方式對核桃仁蛋白質的消化特性影響較大，其中真空4 ℃下核桃仁蛋白質的消化率較高。

3 結論

隨著貯藏時間的延長，6種貯藏方法下的核桃仁蛋白質的品質、結構和功能特性均發生了不同程度的變化，且溫度與真空度對核桃仁蛋白質品質具有顯著影響。貯藏期間，核桃仁蛋白質的二硫鍵含量和羰基化合物含量顯著上升，游離巰基含量顯著下降；蛋白質的結構在貯藏期間發生改變：β-折疊和無規卷曲度的比例上升，α-螺旋和β-轉角的比例下降，蛋白質結構總體上趨向于無序松散狀態，非真空包裝35 ℃下貯藏9個月后的核桃仁蛋白質的二級結構變化最為明顯，其α-螺旋下降至18.37%，β-折疊上升至32.94%。蛋白質功能特性方面：貯藏期間核桃仁蛋白質由于其結構的破壞使得疏水性基團暴露導致表面疏水性增加，溶解度下降，其中非真空35 ℃下的變化最為明顯，表面疏水性從4 049.7增長至9 165.9，而溶解度由25.63%降低至3.27%；此外，核桃仁蛋白質聚集度的上升與蛋白質結構的改變掩蓋了胃蛋白酶的作用位點，降低了核桃仁蛋白質的消化特性，且真空4 ℃下貯藏的核桃仁蛋白質的消化率最好。后續可探究核桃仁蛋白質的品質變化機理及調控策略方法等，以提高其開發應用的廣度和深度。

圖5 核桃仁蛋白質的水解程度

圖6 核桃仁蛋白質體外消化分解產物分子量分布

圖7 核桃仁蛋白質貯藏9個月后消化產物維恩圖