秋香梨果醋醋酸發酵工藝優化及抗氧化活性研究

顏飛翔 朱 丹 牛廣財 魏文毅 王思溥

(1. 黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2. 黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319；3. 黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

秋香梨是黑龍江省農科院園藝所培育而成的秋子梨(PyrusussuriensisMaxim.)品種，果實圓形，肉質細膩多汁，可溶性固形物含量高，酸甜適口，是加工梨汁的優良品種[1]。梨功效在中國歷代本草學中均有記載[2]。近年來，因梨中含有多酚、類黃酮、綠原酸等生理活性物質，其具有較好的抗氧化活性[3]。現代醫學研究[4]也證實了梨的清熱鎮靜和降低血壓的作用。目前梨規模化生產的加工產品主要以果汁、梨膏、罐頭類為主，而其他梨酒、梨醋等產品較少。

果醋一般是以水果為原料，經酶解處理、酒精發酵和醋酸發酵而成的一種營養豐富的酸性調味品，富含維生素、氨基酸和碳水化合物，能夠補充人體所需的營養物質[5]。果醋可以改善肥胖、糖尿病、心血管疾病和癌癥等[6]。目前，中國已有學者對庫爾勒香梨[7]、雪花梨[8]、皇冠梨[9]等梨醋的發酵工藝進行了研究，但有關秋香梨果醋的發酵工藝及抗氧化能力評價尚未見報道。

研究擬采用液態發酵方法，在單因素試驗的基礎上，利用響應面法優化滬釀1.01醋酸菌發酵秋香梨果醋的工藝條件，并通過1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基清除能力、2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除能力和Fe3+還原能力來評價秋香梨果醋的抗氧化能力，為秋香梨果醋的工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

秋香梨酒：酸質量濃度為1.5 g/L，酒精度為12%vol(20 ℃)，黑龍江省農業科學院園藝分院；

菌種：滬釀1.01醋酸桿菌，黑龍江省八一農墾大學食品學院發酵實驗室保存；

DPPH：純度>97%，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；

ABTS：純度>99%，美國Sigma公司；

其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器設備

恒溫震蕩培養箱：HZXQ-R型，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；

震蕩培養箱：HZQ-F160型，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；

全溫震蕩培養箱：HZQD-D型，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；

電子分析天平：BN2484型，上海民橋精密儀器有限公司；

立式壓力滅菌鍋：LDZX-40Ⅱ型，上海申安醫療器械廠；

超凈工作臺：BCN-1360型，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；

pH計：SG2型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

過濾機：EYCKW-1型，溫州市東頂機械制造有限公司；

冰箱：BCD-235YH型，青島海爾股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 秋香梨果醋加工工藝

醋酸菌

↓

秋香梨酒→酒度調整→接種→醋酸發酵→陳釀→澄清過濾→殺菌→成品

操作要點：

(1) 酒度調整：參照董玉新[10]的方法，修改如下：取500 mL酒精度為12%vol的秋香梨原酒，根據前期預試驗，用純凈水將酒精度調整為7%vol(20 ℃)。

(2) 醋酸菌活化：向500 mL三角瓶中加入葡萄糖1 g，酵母膏1 g，蒸餾水100 mL，真空度0.1 MPa下滅菌30 min，接入醋酸菌，30 ℃震蕩培養24 h，得活化好的醋酸菌，菌數達5×106CFU/mL，備用。

(3) 接種：取500 mL梨酒于1 000 mL三角瓶中，在超凈工作臺上接入不同接種量的醋酸菌液。

(4) 醋酸發酵：將接種后的三角瓶放入恒溫震蕩箱中，轉速為130 r/min，在試驗設計的接種量、發酵時間、發酵溫度和初始pH等條件下進行發酵。

(5) 陳釀：秋香梨果醋發酵液于室溫陳釀30 d。

(6) 澄清過濾：陳釀結束后除去大部分菌株代謝物和部分沉淀后，添加質量分數為0.5%的殼聚糖，處理1 h，過濾。

(7) 殺菌：采用巴氏殺菌，75 ℃殺菌20 min。

1.2.2 單因素試驗

(1) 接種量對秋香梨果醋醋酸發酵的影響：固定酒精度7%vol，初始pH 4.4，發酵溫度31 ℃，發酵時間7 d，考察接種量(4%，6%，8%，10%，12%)對總酸含量的影響。

(2) 發酵時間對秋香梨果醋醋酸發酵的影響：固定酒精度7%vol，初始pH 4.4，發酵溫度31 ℃，接種量10%，考察發酵時間(1，2，3，4，5，6，7 d)對總酸含量的影響。

(3) 發酵溫度對秋香梨果醋醋酸發酵的影響：固定酒精度7%vol，初始pH 4.4，發酵時間7 d，接種量10%，考察發酵溫度(25，28，31，34，37 ℃)對總酸含量的影響。

(4) 初始pH對秋香梨果醋醋酸發酵的影響：固定酒精度7%vol，發酵溫度31 ℃，發酵時間7 d，接種量10%，考察初始pH(3.2，3.8，4.4，5.0，5.6)對總酸含量的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素試驗的基礎上，固定初始酒精度為7%vol，選取接種量、發酵溫度、發酵時間和初始pH為自變量，以總酸含量為響應值，采用Box-Behnken中心組合原理設計四因素三水平響應面試驗，優化秋香梨果醋醋酸發酵工藝。

1.2.4 指標測定

(1) 酒精度：蒸餾法。

(2) 總酸含量：常規酸堿滴定法(以醋酸計)。

(3) DPPH自由基清除率：根據樊秋元等[11]的方法。

(4) ABST自由基清除率：根據杜朝東等[12]的方法。

(5) Fe3+還原力：根據樊秋元等[13]的方法。

1.3 數據統計分析

所有試驗重復3次，采用Origin 8.5軟件繪圖，響應面試驗通過Design-Expert 8.0.6進行試驗設計和數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1(a)可知，秋香梨果醋中總酸含量隨接種量的增加先升高后降低，當接種量為10%時，總酸含量最高達53.31 g/L；當接種量>10%時，由于營養物質多消耗在菌體細胞的生長繁殖上，同時會出現菌體過早老化，生成的醋酸量減少，影響發酵效果[14]。因此，選擇秋香梨果醋發酵的醋酸菌最佳接種量為10%。由圖1(b)可知，秋香梨果醋中總酸含量隨發酵時間的延長先升高后略降低，發酵第6天，發酵液的總酸含量達到峰值，繼續發酵則發酵液中的總酸含量呈下降趨勢。這可能是隨著發酵時間的延長，營養物質被逐漸消耗，當發酵液中營養物質(尤其是酒精)缺乏時，醋酸菌會分解醋酸，出現過氧化現象，酸度降低[15]。因此，選擇6 d為最佳發酵時間。

圖1 各因素對秋香梨果醋醋酸發酵的影響

由圖1(c)可知，秋香梨果醋中總酸含量隨發酵溫度的升高先上升后下降，當發酵溫度<31 ℃時，醋酸菌的代謝活動減弱，總酸含量較低；隨著發酵溫度的升高，31 ℃時秋香梨果醋的總酸質量濃度最高值達51.98 g/L；當溫度>31 ℃時，高溫會抑制醋酸菌中相關酶的活性，產酸量降低[16]；因此，31 ℃為最佳發酵溫度。由圖1(d)可知，隨著pH值的增加，總酸含量先升高后急速下降。當初始pH為4.4時，發酵液中總酸質量濃度達最高52.11 g/L。當初始pH>4.4時，醋酸菌細胞的生理功能受影響，秋香梨果醋的酸度急劇降低，同時影響產品品質[17]。因此，最佳初始pH選擇4.4。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應面因素水平設計 根據單因素試驗結果，以接種量、發酵溫度、發酵時間和初始pH為自變量，以總酸含量為響應值，進行四因素三水平的響應面試驗設計，因素及水平編碼見表1，試驗設計與結果見表2。

2.2.2 回歸方程的建立及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6數據分析軟件對表2中數據進行處理，經回歸擬合后得到二次回歸方程：

表1 因素與水平編碼表

Y=52.76-2.96X1+0.39X2-0.41X3+0.78X4-

(1)

2.2.3 響應面分析 響應曲面的陡度及等高線與坐標軸交點個數能在一定程度上反映試驗因子對響應值影響的大小。若曲面坡度平緩，則因素值的變化對響應值影響較小；反之，則影響較大。等高線與坐標軸交點個數越多，則對響應值影響越大；反之，則較小。等高線的形狀越扁平也說明交互作用越強。對秋香梨果醋中總酸含量影響顯著的交互項有X1X2和X1X4。其響應面圖和等高線圖如圖2所示。由圖2可知，響應面圖非常陡峭，等高線圖也呈現較扁平的橢圓形，并且X1對總酸含量的影響大于X2和X4，與方差分析結果一致。

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.4 實驗驗證 利用已建立的數學模型預測秋香梨果醋醋酸發酵的最佳工藝條件為醋酸菌接種量9.45%，發酵時間5.90 d，發酵溫度31.15 ℃，初始pH 4.49。考慮實際操作，修正工藝條件為醋酸菌接種量9.4%，發酵時間6 d，發酵溫度31 ℃，初始pH 4.5，此條件下的總酸含量為54.45 g/L，與理論預測值53.25 g/L誤差較小，說明該模型能較好地預測秋香梨果醋的醋酸發酵工藝。

表3 回歸模型的方差分析?

2.3 秋香梨果醋的抗氧化能力

由表4可知，發酵后秋香梨果醋的抗氧化能力顯著提高(P<0.05)，ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率和還原力分別較發酵前提高了23.65%，21.17%，30.23%，與廖良坤等[18-19]的結果一致。Merve等[20]研究發現，酸櫻桃醋的抗氧化能力與其功能性化合物如沒食子酸和綠原酸有關；陳怡等[21]研究表明，釀造醋的總多酚、總黃酮含量與總抗氧化能力以及超氧自由基、DPPH自由基和羥基自由基清除率均極顯著相關(P<0.01)；孫璐宏等[22]研究表明，柿果醋的總抗氧化能力與總酸含量呈極顯著正相關(P<0.01)。因此，發酵后秋香梨果醋的抗氧化性能顯著提高，可能與果醋發酵過程中醋酸含量大幅上升有關。同時，隨著發酵時間的延長，梨醋中的醇類和醛類化合物會氧化成酸類化合物，如乙酸和己酸[23-24]。此外，還與發酵帶來的一些微生物其他發酵產物和次生代謝產物，如轉化黃酮和生物堿類物質，以及發酵過程中多種有機酸的相互作用有關。

3 結論

秋香梨果醋醋酸發酵的最佳發酵工藝參數為醋酸菌接種量9.4%，發酵時間6 d，發酵溫度31 ℃，初始pH 4.5，此條件下秋香梨果醋總酸含量為54.45 g/L。秋香梨酒經醋酸菌發酵后，表現出了良好的體外抗氧化能力，其DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和Fe3+還原能力分別提高了21.17%，23.65%，30.23%。后續將對該果醋發酵過程中品質及發酵前后風味成分變化進行分析。

圖2 各因素對總酸質量濃度的交互作用

表4 秋香梨果醋的抗氧化能力?