草菇組織分離繼代中菌種退化對相關酶活力的影響

王巧莉，孔梓璇，譚強飛，贠建民，張紊瑋，趙風云

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州, 730070)

草菇(Volvariellavolvacea)，又名稻草菇，是世界第三大栽培的食用菌。其肉質鮮嫩、香味濃郁，有較高的營養價值和醫用價值[1-2]，是熱帶和亞熱帶地區廣受歡迎的栽培蘑菇之一[3]。目前，草菇從傳統的小農種植逐漸轉向工廠化生產。據統計，我國草菇年產量約為33萬t，占全球產量的80%[4]。同其他食用菌一樣，菌種退化是限制草菇生產和發展的重要因素。草菇是典型的高溫型食用菌，不耐低溫貯藏的特性，使其退化現象尤為嚴重。

草菇的栽培原料一般為天然植物纖維，如稻草、棉籽殼等，其主要成分為纖維素、半纖維素、木質素等[5]。這些大分子高聚物必須在相應的降解酶作用下轉化為低分子化合物才能被菌絲吸收利用，以維持菌絲生長及提供出菇的能量，因此草菇的生物學效率與其產生的降解酶活性有較大的關聯性[6]。草菇在生長過程中，產生的外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶共同作用分解纖維素，產生漆酶、錳過氧化物酶等分解木質素[7]，產生木聚糖酶等以分解半纖維素[8]。

組織分離是指從食用菌子實體組織中分離純菌絲體進行繁殖的方法，常用于食用菌菌種提純和復壯。胡中娥等[9]通過組織分離技術提高了北冬蟲夏草菌種的菌絲活力和生物學效率。趙風云等[10]利用單孢分離結合組織分離技術獲得了草菇高產菌株。但草菇連續多次組織分離是否會引起菌種退化，致其退化的機制是什么，目前尚未見系統報道。

本文利用連續組織分離方法獲得了18代草菇繼代菌株，測定分析各菌株的基質降解相關酶活力，結合轉錄組數據探討草菇組織分離繼代過程中的退化現象及相關酶活力變化，以期為草菇菌種退化鑒定及退化機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

原種(T0)：草菇菌株V844保藏于甘肅農業大學食品科學與工程學院。

繼代菌種(T1～T18)：將T0進行栽培試驗獲得子實體，并經組織分離得到T1，將T1進行栽培，得子實體進行組織分離得T2，以此方法得到18株組織分離繼代菌株T1～T18。

草菇原種T0和繼代菌種T1～T18均于20 ℃恒溫保存于液體石蠟中。

1.1.2 培養基

PDA 培養基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO41.0 g，MgSO41.0 g，瓊脂粉 2 g，去離子水1 000 mL，pH 自然。

液體發酵培養基：粉碎的棉籽殼10 g，酵母抽提物5 g，KH2PO40.6 g，MgSO40.5 g，去離子水1 000 mL，pH 自然。

1.2 實驗方法

1.2.1 草菇生理性狀測定

氣生菌絲密度：將T0～T18共19個菌株統一活化后，放置于30 ℃的恒溫培養箱中，培養3 d后觀察并記錄氣生菌絲密度。

菌絲生長速度(mm/h)：參照安學明等[11]方法測定。

菌絲生物質量(g)：將統一活化好的菌株用直徑6 mm的打孔器接種1個菌絲塊于新鮮PDA平板上，30 ℃培養3 d，然后輕輕刮下菌絲體，用分析天平稱量，記錄數據。

1.2.2 相關酶活力的測定

粗酶液的制備：將統一活化好的菌株用直徑6 mm的打孔器接種3個菌絲塊于液體培養基中。在33 ℃，200 r/min搖床中培養8 d，定期取發酵液。將發酵液在4 ℃，11 000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液即為粗酶液。

外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、濾紙酶和半纖維素酶活力測定均采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法[12]；漆酶活力測定采用ABTS法[13]；錳過氧化物酶活力測定參照崔堂武等[14]的方法；木聚糖酶活力測定參考王曉丹等[15]的方法。

1.2.3 轉錄組學分析

將T0、T4、T8、T12和T16共5個菌株在PDA平板上統一培養3 d，收集菌絲體放入滅酶冷凍管中，迅速放入液氮中冷凍，并送至上海歐易生物醫學科技有限公司進行轉錄組測序實驗。

參照楊新等[16]的方法從轉錄組學數據中篩選出與基質降解相關酶的差異表達基因，并對這些數據進行統計分析。

1.3 數據處理

每個菌株的所有指標測定均設3組重復，采用Microsoft Excel 2010進行數據統計處理，采用Origin 9.0和Heatmap軟件作圖，用Spss 19.0統計軟件對數據進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 組織分離繼代對草菇生理性狀的影響

2.1.1 氣生菌絲密度的變化

將T0～T18在PDA平板上統一培養，第3天觀察并記錄氣生菌絲密度，結果如圖1所示。T0～T11氣生菌絲密度變化不明顯。從T12開始，隨著繼代次數增加，氣生菌絲密度開始降低，菌落直徑逐漸減少，菌株呈現退化趨勢。

圖1 草菇氣生菌絲密度的變化Fig.1 Changes of mycelial density of Volvariella volvacea注：培養基直徑90 mm

2.1.2 菌絲生長速度和菌絲生物質量的變化

由圖2可知，隨著繼代次數的增加，菌絲生長速度和菌絲生物質量均呈現先增加后降低的變化趨勢，菌絲生長速度與菌絲生物質量之間呈現明顯的正相關。菌絲生長速度在T8達到峰值，而后下降，T12以后下降趨勢明顯加快，T18的菌絲生長速度較T0降低了14.7%。菌絲生物質量在T4達到峰值，而后下降，菌株T12～T18的生物質量均顯著

圖2 草菇菌絲生長速度和菌絲生物質量的變化Fig.2 Changes of mycelial growth rate and mycelial biological quality in Volvariella volvacea

2.2 組織分離繼代對基質降解酶活力的影響

2.2.1 纖維素降解相關酶活力的變化

纖維素降解相關酶活力變化如圖3所示。外切葡聚糖酶呈現先上升后下降的趨勢，在T4時達到了峰值，T18的酶活力較T0降低了34.2%(圖3-a)。內切葡聚糖酶活力從T0到T6差異不顯著(P>0.05)，從T7開始，隨著繼代次數的增加，呈現下降趨勢，T12以后下降趨勢加快，T18的酶活力較T0降低了66.7%(圖3-b)。β-葡萄糖苷酶活力變化差異不顯著(P>0.05)(圖3-c)。濾紙酶活力從T0到T4差異不顯著(P>0.05)，從T5開始，隨著繼代次數的增加，呈現下降趨勢，T18的酶活力較T0降低了86.4%(圖3-d)。

a-外切葡聚糖酶；b-內切葡聚糖酶；c-β-葡萄糖苷酶；d-濾紙酶圖3 纖維素降解相關酶活力的變化Fig.3 Changes in cellulose degradation-related enzymes activity注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.2 木質素降解相關酶活力的變化

木質素降解相關酶活力的變化如圖4所示。漆酶和錳過氧化物酶活力均呈先上升后下降趨勢。漆酶活力從T0到T4逐漸增高，在T4達到峰值，而后逐漸下降，T18的酶活力較T0降低了71.1%(圖4-a)。錳過氧化物酶活力在T5達到峰值，而后逐漸下降，T18的酶活力較T0降低了90.0%(圖4-b)。

a-漆酶；b-錳過氧化物酶圖4 木質素降解相關酶活力的變化Fig.4 Changes in lignin degradation-related enzymes activity

2.2.3 半纖維素降解相關酶活力的變化

半纖維素降解相關酶活力的變化如圖5所示。木聚糖酶活力從T0到T4差異不顯著(P>0.05)，從T5開始，隨著繼代次數的增加，呈現下降趨勢，T18的酶活力較T0降低了67.9%(圖5-a)。半纖維素酶活力呈先上升后下降趨勢，在T8達到峰值后逐漸下降，T18的酶活力較T0降低了58.7%(圖5-b)。

2.2.4 相關酶的差異表達基因分析

分析轉錄學組數據，篩選出34個與基質降解相關的差異表達基因。由圖6可知，外切葡聚糖酶(jgi|Volvo1|118037)、β-葡萄糖苷酶(jgi|Volvo1|120086)基因先上調后下調；內切葡聚糖酶(jgi|Volvo1|115063、jgi|Volvo1|114279)、木聚糖酶(jgi|Volvo1|120751、jgi|Volvo1|121659)基因下調；漆酶家族的jgi|Volvo1|115448、jgi|Volvo1|115483下調，jgi|Volvo1|115484、jgi|Volvo1|115506上調，jgi|Volvo1|115476先上調后下調；錳過氧化酶家族的jgi|Volvo1|114735、jgi|Volvo1|113255、jgi|Volvo1|115023下調，jgi|Volvo1|116037上調。其余19個(8個下調，5個上調，6個先上調后下調)均為碳水化合物家族相關基因，間接參與草菇基質降解。

a-木聚糖酶；b-半纖維素酶圖5 半纖維素降解相關酶活力的變化Fig.5 Changes in hemicellulose degradation-related enzymes activity

圖6 基質降解相關差異表達基因的表達量變化Fig.6 Changes of differentially expressed genes related to substrate degradation

3 討論與結論

根據營養源不同，可將食用菌分為木腐菌和草腐菌。草菇屬于典型的草腐菌，以稻草、麥稈、廢棉、棉籽殼等為生長基質，這些基質中均含有大量的纖維素、半纖維素及部分木質素，為草菇的生長發育提供碳源等營養物質[17]。在生長過程中，草菇菌絲首先在纖維素的末端開始分解；再從端部進入基質內部，由內向外分泌纖維素酶(外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等)和半纖維素酶(木聚糖酶等)，使其共同作用降解基質[18-20]。漆酶、錳過氧化酶可以破壞木質素結構，使較多的纖維素分子裸露出來，由纖維素酶將基質大分子降解為單分子葡萄糖[21]。測定基質降解相關酶活力可以在一定程度上反映出草菇對基質的利用效率。

轉錄組學是一門在整體上研究細胞中基因轉錄情況及轉錄調控規律的學科，是在mRNA水平上研究基因的表達情況[22]。本文通過轉錄組學分析發現與纖維素酶、半纖維素酶、木質素酶有關的差異表達基因34個，主要差異表達基因如外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和部分漆酶基因隨著繼代次數的增加先上調后下調；內切葡聚糖酶、木聚糖酶和部分錳過氧化酶基因下調。基質降解相關酶活力測定表明，隨著繼代次數的增加，外切葡聚糖酶、半纖維素酶、漆酶和錳過氧化物酶活力先增加后下降，木聚糖酶、內切葡聚糖酶和濾紙酶呈下降趨勢。生理性狀指標檢測表明，氣生菌絲密度和菌落直徑隨繼代次數的增加逐漸降低，菌絲生長速度和菌絲生物量先增加后下降。綜上可知，轉錄組學、相關酶活及生理性狀在連續繼代過程中的變化趨勢基本一致。初步推測，在草菇連續組織分離繼代過程中，mRNA轉錄水平的差異表達導致蛋白表達即相關酶活力的變化，最終影響了草菇表觀性狀如氣生菌絲密度、菌絲生長速度等指標的改變。

綜合分析草菇組織分離繼代菌株的生理性狀、相關酶活及轉錄組學發現，當連續組織分離繼代4次時，草菇菌種有明顯地復壯效果，但當連續繼代12次以上時，組織分離繼代會導致菌種出現退化現象。