預處理工藝對黑蒜功能性成分、抗氧化活性影響及相關性研究

牛娜娜，沙如意*，楊陳銘，王珍珍，茹語婷，戴靜，韓洪庚，張黎明，毛建衛,3*

1(浙江科技學院 生物與化學工程學院，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江省農業生物資源生化制造協同中心， 浙江 杭州，310023)2(江蘇福多美生物科技有限公司，江蘇 徐州，221354)3(浙江工業職業技術學院，浙江 紹興，312000)

大蒜屬于百合科蔥屬植物，是一種藥食兩用草本植物[1]，含有豐富的碳水化合物、有機硫化合物和酚類化合物等，具有抗氧化、抗菌消炎、降血糖等功效[2]。大蒜的化學成分因品種、產地、氣候和種植等條件而有顯著性差異[3]。大蒜主要被用作調味品，因其具有強烈的刺激性氣味，難以被大多數人所接受，因而降低了大蒜的實際利用率。黑蒜是新鮮大蒜在高溫、高濕條件下加工而成，蒜體呈黑色，故名“黑蒜”。黑蒜相比較于大蒜，其辣味和刺激性氣味明顯降低，口感甘甜，更易受消費者的喜愛。黑蒜具有顯著的抗氧化、抗炎[4]、改善心血管功能、降脂[5]、降血糖[6]和保護肝臟[7]等功效。

目前，黑蒜制備工藝多采用變溫熟化的方式，目前存在著熟化周期較長(一般為2～3個月)，耗能較大，生產成本較高的問題[8]。物理預處理(如冷凍、高溫等)工藝是果蔬加工過程中常用的前處理技術。冷凍可以增強大蒜細胞膜的通透性，高溫預處理可以破壞細胞結構，這些預處理工藝均有利于細胞組織液的流出，從而加速黑蒜熟化過程中的美拉德反應，縮短加工時間[9]。微生物預處理也常用于食品加工過程，以期達到過程強化的目的。黑蒜加工產品形式多樣，黑蒜產品有獨頭黑蒜、多瓣黑蒜，黑蒜再制品有黑蒜果醬、黑蒜飲料、黑蒜粉等[10-11]。本研究以物理預處理(冷凍和高溫預處理)和微生物預處理工藝制備黑蒜產品，對不同預處理工藝制備的黑蒜產品進行理化指標、活性成分和抗氧化活性分析，為黑蒜產品的研發提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜，江蘇邳州；酵母，中國食品發酵工業研究院有限公司；DPPH，日本TCI公司；甲醇(優級純)，美國Thermo Fisher Scientific公司；磷酸(色譜級)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine, SAC)、5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural, 5-HMF)標準品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余試劑均為國產分析純。

雙溫控高低溫濕熱箱，上海智籌試驗儀器設備廠；高速中藥粉碎機，瑞安市永歷制藥機械有限公司；G-100ST超聲波清洗機，深圳市歌能清洗設備有限公司；RE 52-99旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；低溫冷卻液反應浴，鞏義市予華儀器有限責任公司；UV-5500PC紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；LY15-9053A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海龍躍儀器設備有限公司；SpectraMax iD5多功能酶標儀，美國Molecular Devices公司；916 Ti-Touch電位滴定儀，瑞士Metrohm公司；FiveEasy Plus pH計，CM-5分光測色計，日本 Konica Minolta 公司；美國Waters e2695型高效液相色譜，Waters 公司。

1.2 方法

1.2.1 黑蒜制備工藝

取無霉變、無腐爛、無機械損傷的大蒜5 000 g，分為4組處理：不進行預處理；-20 ℃冷凍24 h；置于含有107 CFU/mL的酵母菌溶液中預處理2 h；121 ℃高溫預處理15 min。然后置于恒溫恒濕箱中，(75%濕度、70 ℃)，熟化30 d，每隔5 d取1次黑蒜樣品。

1.2.2 黑蒜提取液的制備

將黑蒜去皮剪碎，放置于粉碎機中進行粉碎，取出粉碎后的黑蒜樣品5 g放置錐形瓶中，按料液比1∶20(g∶mL)加入體積分數60%的乙醇，設置初始溫度40℃、功率600 W下超聲提取30 min，6 000 r/min離心15 min后取上清液，再對殘渣提取1次，合并上清液，50 ℃旋轉蒸干，定容至50 mL，樣品保存至-80 ℃ 冰箱中備用。

1.2.3 色度的測定

參照范昊安等[12]的方法，使用分光測色計對黑蒜提取液進行測定，以去離子水為參比溶液,計算色差值ΔE。

1.2.4 褐變程度的測定

參照姜紹通等[13]的方法，將黑蒜提取液稀釋10倍后，利用分光測色計進行測定。

1.2.5 總酚含量測定

采用Folin-Phenol法[14]測定黑蒜提取液中總酚含量。

1.2.6 可溶性蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍G250法[15]測定黑蒜提取液中可溶性蛋白質含量。

1.2.7 可滴定酸含量測定

參照GB/T 12456—2008 《食品中總酸的測定》[16]，使用電位滴定儀測定黑蒜提取液的可滴定酸含量，測定結果以乳酸含量(g/100mL)計。

1.2.8 pH的測定

使用pH計測定黑蒜提取液的pH值[17]。

1.2.9 SAC和5-HMF含量測定

采用高相液相色譜法測定SAC和5-HMF含量[18-20]。液相色譜分析條件：Waters e 2695 高效液相色譜儀，色譜柱：Atiantis?T3 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長為 214 nm，V(甲醇)∶V(0.01%磷酸溶液)=10∶90，柱溫20 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL。配制濃度分別為2、4、6、8、10 μg/mL的SAC、5-HMF混合標準品，上機檢測。SAC標準曲線為：y=926 800x+170 794，R2=0.999 6(x為濃度，單位 μg/mL，y為峰面積)；5-HMF標準曲線：y=606 742x-34 800，R2=0.999 9(x為質量濃度，單位 μg/mL，y為峰面積)。將黑蒜提取液利用0.01%磷酸溶液稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜，上機檢測。

1.2.10 抗氧化能力的測定

1.2.10.1 羥自由基清除能力的測定

參照張浩然等[21]方法進行測定，將黑蒜提取液稀釋4倍，進行羥自由基清除能力的測定。

1.2.10.2 ABTS自由基清除能力的測定

參照程勇杰等[22]方法進行測定，將黑蒜提取液稀釋75倍，進行ABTS自由基清除能力的測定。

1.2.10.3 還原力的測定

參照薛淑龍等[23]方法進行測定，將黑蒜提取液稀釋25倍，進行還原力測定。吸光值越高，代表還原力越強。

1.3 數據統計與分析

每組實驗均重復3次，采用GraphPad Prism 8.0軟件繪制圖，結果以平均值±標準差(SD)表示。利用SPSS 22軟件進行相關性分析，利用HemL 1.0 軟件進行相關性熱圖分析。

2 結果與分析

2.1 黑蒜制備過程中色度的變化

色澤可以反映黑蒜制備過程中的褐變情況，是衡量黑蒜品質的重要指標。色度ΔE表示黑蒜制品顏色的深淺，其值越大表明顏色越深，褐變程度越深，產品成色越好[8]。如圖1所示，0～5 d，不同預處理工藝制備的黑蒜色度顯著增加。從第15天開始，色度幾乎維持不變。整個熟化過程中，不同預處理組的黑蒜樣品色度無顯著差異。陳玲[24]研究表明，鮮蒜中的還原糖和氨基酸相互作用，發生羰氨反應，生成類黑精，是使得蒜瓣變黑的主要原因，且反應前期溫度越高，褐變速度越快，反應后期，蒜瓣褐變速度趨于平緩。

圖1 黑蒜制備過程中色度的變化Fig.1 Color change of black garlic during preparation

2.2 黑蒜制備過程中褐變程度的變化

黑蒜制備過程中褐變程度的變化如圖2 所示，褐變程度呈現出先持續升高后趨于平穩的趨勢，發酵第20 天，各預處理組影響褐變的程度為：微生物預處理組>冷凍預處理>對照組>高溫高壓預處理組。其中，微生物預處理組影響褐變的速率較快，在發酵至第20天時，褐變程度即達到最高值0.711±0.03，表明進行酵母菌的微生物預處理更加有利于褐變的進行。有研究表明低溫預處理和高溫水煮預處理均可以破碎細胞組織結構，促使糖類物質的分解和還原糖的積累，可以加速美拉德反應，縮短加工時間[25]。在黑蒜的制備過程中，前期適宜的溫度加快了各類酶的催化反應，使得大蒜中的大分子物質不停地水解生成小分子物質，如：蛋白質水解為各種氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸含量較多，可溶性糖含量不斷增加，釋放出更多的酚羥基，多酚含量不斷升高[26]，從而加速美拉德反應。與對照組相比，微生物預處理工藝和冷凍預處理在較短的加工時間內，可以較快地達到需要的黑蒜褐變程度，均有利于縮短大蒜的褐變時間。

圖2 黑蒜制備過程中褐變程度的變化Fig.2 Changes of browning degree of black garlic during preparation

2.3 黑蒜制備過程中總酚含量的變化

酚類物質是黑蒜中一種重要的功能性成分，具有典型的抗氧化性活性，是衡量黑蒜品質的重要指標之一。不同預處理制備黑蒜過程中總酚含量的變化如圖3所示，隨著熟化時間的延長，4種工藝制備的黑蒜樣品在發酵過程中總酚含量均呈現出上升的趨勢，發酵至第30 天，黑蒜中總酚含量為：微生物預處理發酵組、對照組>冷凍預處理組>高溫高壓預處理組，其中微生物預處理組和對照組對于總酚含量的積累無顯著差異(P<0.05)，黑蒜成熟后，其總酚含量遠高于鮮蒜，為黑蒜中的9.55倍。羅海清[27]研究表明黑蒜總酚含量比大蒜總酚含量多了2.11 mg/g。侯笑林等[28]研究表明:采用體積分數50%的乙醇,料液比為1∶20(g∶mL)，60 ℃溫度下提取60 min，浸提法提取黑蒜總酚含量的提取量可達1.82 mg/g。

圖3 黑蒜制備過程中總酚含量的變化Fig.3 Changes of total phenols in the process of black garlic preparation

2.4 黑蒜制備過程中可溶性蛋白質含量的變化

黑蒜制備過程中可溶性蛋白質含量的變化如圖4所示，隨著發酵時間的延長，可溶性蛋白質含量均呈上升趨勢。不同預處理后的鮮蒜樣品中可溶性蛋白質的含量存在差異，鮮蒜經過酵母菌浸泡之后，表面會帶有一些菌種，使得微生物預處理發酵組初始可溶性蛋白含量高于其他組，程方等[29]相關研究表明：啤酒酵母自身菌體所含粗蛋白含量較高，使得添加啤酒酵母發酵的馬鈴薯渣中的粗蛋白含量較未接菌增加了3.14%；經過高溫高壓預處理組的鮮蒜，因蛋白質產生熱變形，造成可溶性蛋白質含量下降。張譽穩等[30]相關研究表明：紫花苜蓿葉片和根部在高溫(30 ℃)脅迫下，可溶性蛋白含量分別在0～6 h下降17.52%和18.51%。在發酵第20天時，4種預處理工藝制備的黑蒜樣品在發酵過程中蛋白質含量由大到小為微生物預處理組>對照組、冷凍組>高溫高壓組。隨著熟化時間的延長，可溶性蛋白質逐漸積累，其原因可能是微生物的代謝作用產生了可溶性蛋白質。熟化至第20天，對照組黑蒜中的可溶性蛋白質增加了1.63倍。徐麗華等[31]相關研究表明：在70 ℃發酵15 d后，80 ℃發酵10 d的變溫條件下，蛋白質含量逐漸升高，在發酵25 d時，黑蒜蛋白質含量增加3.14 mg/g DW。

圖4 黑蒜制備過程中可溶性蛋白質含量的變化Fig.4 Changes of total protein in black garlic during preparation

2.5 黑蒜制備過程中可滴定酸的變化

可滴定酸是反映黑蒜品質的理化指標之一。不同預處理工藝制備的黑蒜，可滴定酸含量的變化如圖5所示。由圖可知，隨著發酵時間的延長，可滴定酸的含量均呈上升的趨勢，發酵至第30天時，可滴定酸含量依次為：冷凍組>高溫高壓組>微生物預處理組>對照組。發酵至第30天，冷凍預處理組黑蒜的可滴定酸含量為51.5 mg/g，比鮮蒜含量值高41.3 mg/g，可滴定酸含量的增加是黑蒜在口感上呈酸甜的重要原因，可滴定酸含量的升高與發酵過程中乳酸、醋酸等有機酸的生成有關[14]。與對照組相比，在黑蒜制備過程中，微生物預處理組和冷凍預處理工藝均可提高黑蒜產品中可滴定酸含量。

圖5 黑蒜制備過程中可滴定酸的變化Fig.5 Changes of titratable acid in the preparation of black garlic

2.6 黑蒜制備過程中pH的變化

pH也是反映黑蒜制備過程中的重要理化指標之一，不同預處理工藝制備的黑蒜在發酵過程中pH的變化如圖6所示。由圖6可知，隨著發酵時間的延長，pH均幾乎呈現直線下降的趨勢，與可滴定酸含量的變化呈相反的趨勢。黑蒜熟成后，pH值低至4.20±0.01。不同預處理工藝對制備的黑蒜pH無明顯差異。有研究表明，黑蒜提取物抗氧化活性隨pH值的升高而下降，在pH值7.0以下，其抗氧化活性隨pH值的升高下降的程度較慢；在pH 值7以上的環境下，其抗氧化活性下降得較快[32]。因此，在黑蒜的加工過程中，pH的下降更有利于提高其抗氧化性。

圖6 黑蒜制備過程中pH的變化Fig.6 Changes of pH in the process of black garlic preparation

2.7 黑蒜中的SAC、5-HMF的高效液相色譜圖

圖7為黑蒜中的SAC、5-HMF的HPLC色譜圖，樣品中SAC的保留時間為5.875 min，5-HMF的保留時間為11.276 min，與標準品的保留時間相一致。

圖7 黑蒜樣品中的SAC、5-HMF的HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of SAC and 5-HMF in black garlic

2.8 黑蒜制備過程中SAC和5-HMF含量的變化

SAC是一種水溶性含硫化合物，主要存在于大蒜[33]和洋蔥[34]中，其性質穩定，無色無味，具有抗氧化性[35]、提高免疫力、抗腫瘤[36]、預防老年癡呆[37]等功效。在以前的大蒜研究中，研究者多關注于大蒜中脂溶性大蒜素的功效及組分，最近KODERA等[38]研究表明鮮蒜中約有20～30 mg/g的SAC，而BAE等[39]相關研究表明黑蒜中的SAC含量是鮮蒜的5～6倍。不同預處理工藝制備得到的黑蒜，在發酵過程中其中的SAC含量變化如圖8所示。由圖8可知，隨著發酵時間的延長，不同預處理組制備的黑蒜中，SAC含量呈現出明顯增加的趨勢，其中微生物預處理組、冷凍預處理組和對照組中的SAC含量明顯高于高溫高壓預處理組。SAC與γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutaml transpeptidase，γ-GTP)活性相關，γ-GTP活性受生產溫度和SAC組成影響，γ-GTP活性的最佳溫度是40 ℃[40]。較低的發酵溫度，有利于得到高含量SAC的黑蒜，這也是經過高溫高壓預處理后得到的黑蒜具有較低含量SAC的原因。

圖8 黑蒜制備過程中的SAC含量變化Fig.8 Changes of SAC content in black garlic during preparation

黑蒜中的5-HMF主要來源于美拉德反應，5-HMF的生成途徑為還原糖在高溫條件下直接裂解產生[41]或還原糖和氨基酸發生美拉德反應[38]，高濃度的5-HMF 具有一定的神經毒性和遺產毒性[42-45]。不同預處理工藝制備的黑蒜中5-HMF含量的變化如圖9所示。由圖9可知，在發酵前15 d，不同預處理組中均未檢測到5-HMF。發酵15 d后，隨著發酵時間的延長，黑蒜制備過程中的5-HMF含量幾乎呈現出線性增加的趨勢，發酵至第30天，5-HMF含量依次為：對照組>冷凍預處理組>微生物預處理發酵組>高溫高壓預處理組。目前研究者對HMF的研究，主要集中在蜂蜜、牛乳、酒類等各類食品中[46]，歐盟將蜂蜜中5-HMF的最大限量設定為40 mg/kg，以確保蜜蜂沒有遭受過度加熱[19]。當 5-HMF 攝入量過高時，會對人體健康有風險，所以一方面需要消費者自身食用量的控制，另一方面可以采取一些調控措施[47]來適當控制其含量。LEE等[19]通過研究沒食子兒茶素沒食子酸鹽浸漬大蒜不同時間，以降低黑蒜中5-HMF的形成，在一定時間內，浸漬時間越長，5-HMF含量降低得越多，且隨著老化時間的延長，黑蒜形成過程中5-HMF的含量產生越少。本研究中利用微生物預處理以降低黑蒜制備過程中HMF的含量，也為黑蒜發酵制備過程的安全控制提供了新的思路。

圖9 黑蒜制備過程中的5-HMF含量變化Fig.9 Changes of 5-HMF content in black garlic during preparation

2.9 黑蒜制備過程中抗氧化能力的變化

2.9.1 黑蒜制備過程中羥自由基清除力的變化

不同預處理后發酵制備黑蒜過程中，黑蒜提取物對于羥自由基清除率的變化如圖10所示。由圖10可知，在發酵第5天時，3種預處理工藝制備的黑蒜樣品對羥自由基清除率呈現出迅速升高的趨勢；在發酵至10～30 d時，不同樣品的羥自由基清除能力呈波動趨勢，方晟等[48]對百合酵素發酵過程中的羥自由基清除能力進行測定，發現40 d時清除能力最高，達到55.72%，隨后下降至42.50%并趨于穩定。發酵至第30天時，3組樣品對羥自由基的清除能力無明顯差異。與發酵前的白蒜相比較，黑蒜在發酵過程中產生大量的酚類、黃酮類及多種美拉德反應產物[49]，這些產物均具有較強的抗氧化活性，因此黑蒜對羥自由基的清除能力高于鮮蒜。

圖10 黑蒜制備過程中羥自由基清除能力的變化Fig.10 Changes of hydroxyl radical scavenging ability of black garlic during preparation

2.9.2 黑蒜制備過程中ABTS自由基清除力的變化

ABTS自由基是一種能夠穩定存在的自由基，根據樣品對ABTS溶液吸光度的影響可以測定其清除自由基的能力[50]。在黑蒜的發酵制備過程中，不同預處理得到的黑蒜樣品對ABTS自由基清除力的變化如圖11所示，由圖11可知，發酵過程中，不同黑蒜樣品對ABTS自由基清除力均呈現出上升后趨于穩定的趨勢，其中發酵前20 d，不同黑蒜樣品對于ABTS自由基清除能力呈現出線性增加的趨勢；發酵25 d后，各組樣品的自由基清除能力趨于穩定，基本保持在90%以上較強的清除率，微生物預處理組、冷凍預處理組、高溫高壓預處理組和對照組均有顯著性差異(P<0.05)。

圖11 黑蒜制備過程中ABTS自由基清除力的變化Fig.11 Changes of ABTS free radical scavenging capacity during the preparation of black garlic

2.9.3 黑蒜制備過程中還原力的測定

黑蒜發酵制備過程中還原力的變化如圖12所示，隨著發酵時間的延長，不同預處理工藝制備的黑蒜樣品還原力均呈現出先線性增加再緩慢升高的趨勢，與ABTS自由基清除能力呈現出相似同的趨勢。發酵至第30天時，進行顯著性分析結果顯示,對照組和3種預處理組之間均有顯著性差異(P<0.05)。有研究表明，樣品中所含有的多酚含量與其還原力能力強弱呈正相關性[51]，還原力越高代表抗氧化能力越強，發酵黑蒜中含有較多的多酚、SAC等活性成分，從而表現出較強的抗氧化活性。

圖12 黑蒜制備過程中中還原力的變化Fig.12 The change of reducing force during the preparation of black garlic

2.10 相關性分析熱圖

以不同預處理工藝后的鮮蒜為原料，進行發酵制備黑蒜，黑蒜中的各種活性成分可能都有助于其抗氧化活性的發揮。為了研究黑蒜中不同的理化指標、功效成分與抗氧化之間的關系，進一步地對黑蒜發酵過程中各理化指標(色差、褐變程度、總酚含量、蛋白質、可滴定酸、pH、SAC含量、5-HMF含量)與抗氧化活性(羥基自由基清除率、ABTS自由基清除率、還原力)進行相關性分析，結果如圖13～圖16所示。由圖可知，不同預處理后發酵制備的黑蒜產品，其主要的理化指標與抗氧化指標之間均表現出明顯的正相關性(pH指標除外)，表明了各種理化指標均對于抗氧化效應具有貢獻。不同預處理組的黑蒜色差、褐變程度、總酚、蛋白質、可滴定酸、SAC、5-HMF與ABTS、還原力之間存在顯著的相關性(P<0.05)；不同預處理工藝發酵制備的黑蒜褐變程度、總酚、蛋白質、可滴定酸、5-HMF與羥自由基清除能力具有正相關性，但不顯著。通過相關性分析熱圖，進一步揭示了黑蒜中的主要活性成分是其具有較強抗氧化活性的主要原因。

圖13 對照組各理化指標與抗氧化活性的相關性 分析熱圖Fig.13 Thermogram of correlation analysis between physical and chemical indexes and antioxidant activity in control group

圖14 冷凍預處理組各理化指標與抗氧化活性的 相關性分析熱圖Fig.14 Thermogram of correlation analysis between physical and chemical indexes and antioxidant activity in freezing group

圖15 微生物預處理組各理化指標與抗氧化活性的 相關性分析熱圖Fig.15 Thermogram of correlation analysis between physicochemical indexes and antioxidant activity in bacterial liquid group

ΔE-色差;BD-褐變程度;TPC-總酚含量;Pr-蛋白質; TTA-可滴定酸;pH-pH 值;H-羥自由基清除率; ABTS-ABTS 自由基清除率;RP-還原力;SAC: S-烯丙基-L-半胱氨酸;5-HMF-5-羥甲基糠醛圖16 高溫高壓預處理組各理化指標與抗氧化活性的 相關性分析熱圖Fig.16 Thermogram of correlation analysis between physical and chemical indexes and antioxidant activity in high temperature and high pressure group

3 結論

本研究利用不同的預處理工藝制備黑蒜，并對其理化指標和抗氧化相關性進行分析，研究結果表明：經微生物預處理、冷凍預處理、高溫高壓預處理后制備的黑蒜，在發酵過程中，其色差、褐變程度均呈現出先上升后趨于穩定的趨勢；總酚、可滴定酸酸、可溶性蛋白質等物質均呈現出上升的趨勢，與相關的抗氧化指標呈現出正相關的趨勢；不同工藝制備的黑蒜所含有的SAC含量均高于鮮蒜，經過預處理后，顯著降低了黑蒜中的5-HMF含量。與對照組相比，微生物預處理再發酵制備黑蒜，有利于縮短大蒜的褐變時間，提高黑蒜中總酚、可溶性蛋白的含量，降低5-HMF含量；冷凍預處理可以縮短大蒜褐變時間，提高黑蒜中可滴定酸含量，降低黑蒜形成過程中的5-HMF；高溫高壓預處理可有效降低5-HMF的含量。