酸漿宿萼抗衰老作用及機理研究

郭佳，李云飛，李詩佳，關紅霞，陳曉光*

1(長春工業大學 人文信息學院，吉林 長春，130122)2(長春工程學院，吉林 長春，130012)

酸漿(PhysalisalkekengiL.)早在《本草綱目》中就有記載，其具有化痰、利濕除熱和清肺止咳等功效。近代研究表明酸漿富含甾體類和黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌和防治糖尿病等功效[1-3]。有關其宿萼(calyx physalis，Cps)的研究相對較少，其主要化學成分為酸漿苦素和黃酮類等化合物[4]。酸漿宿萼提取物能夠抑制小鼠胃癌細胞的生長、增強小鼠免疫能力、顯著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖含量并對革蘭氏陽性菌具有顯著的抑菌效果。此外，酸漿宿萼總皂苷能增加抑癌相關基因caspase-3、細胞色素C、Bax的表達,促進人的SMMC-7721肝癌細胞的凋亡，體現出一定的抗腫瘤作用[5]。酸漿苦素對人前列腺癌PC-3細胞和前列腺LNcAP細胞株具有較強的細胞毒性[6-7]。然而，其在抗衰老方面的研究尚未見報道。目前，有關衰老的研究仍然處于對衰老的認識和動物實驗階段，關于衰老的學說主要有“端粒學說”、“自身免疫學說”和“自由基學說”等，其中自由基學說認為生物體內活性氧自由基含量水平過高會對細胞造成不同程度的氧化損傷，最終導致并加快衰老[8-9]。因此，通過藥物合理降低衰老過程中生物機體內活性氧自由基的水平，成為抗衰老的重要途徑之一。秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，以下簡稱線蟲)，由于其具有繁殖能力強、易于保存、遺傳背景清晰、與人類基因同源性高、信號通路保守等特點，被作為模式動物廣泛應用于抗氧化、抗衰老等實驗研究[10-13]。在已有報道中，茶多酚等多酚類物質能夠通過上調線蟲體內抗氧化相關基因，降低線蟲體內活性氧自由基的水平，延緩線蟲衰老[14-17]。本文以線蟲為模式動物，系統探究酸漿宿萼水提物的抗衰老生物學活性，并以胡桃醌為氧化劑構建體內抗氧化活性檢測體系，評價了不同濃度酸漿宿萼水提物的體內抗氧化生物活性，進一步闡明其作用機理。本研究數據增加了人們對酸漿宿萼生物學作用的認識，為合理利用酸漿宿萼以及抗衰老藥物的研發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 酸漿宿萼水提物的制備

酸漿宿萼采摘于長春八一水庫，經長春中醫藥大學藥學院張鳳瑞教授鑒定為茄科植物酸漿的宿萼。取酸漿宿萼58.81 g，100 ℃水煮40 min，反復3次，合并水煮液，共得3 900 mL水煮液。取水煮液1 900 mL置于70 ℃ 水浴鍋中濃縮，最終1 g濃縮液含1.7 g主藥。將濃縮液在無菌操作臺中分裝于10 mL無菌離心管中，-20 ℃凍存。

1.1.2 酸漿宿萼水提物主要成分

根據已有文獻中的方法對酸漿宿萼水提物中多糖、總酚和總黃酮含量進行測定[18-19]。實驗結果證實1 g酸漿宿萼水提物中多糖、總酚和總黃酮含量分別為0.63 g、1.35 mg和1.22 mg。

1.1.3 秀麗隱桿線蟲蟲株

野生型線蟲N2 (Bristol)，突變體線蟲clk-1(qm30)、daf-2(e1368)、eat-2(ad1116), 購于Caenorhabditis Genetics Center (CGC)。

1.1.4 試劑

蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉、酵母提取物，生工生物工程股份有限公司；DPPH、ABTS、胡桃醌(ST79990120MG-25 mg), 薩恩化學技術有限公司。

1.1.5 儀器與設備

DSPM-508生化培養箱，寧波江南儀器廠；YM-COS-100C水平恒溫搖床，上海豫明儀器有限公司；SW-CJ-2F無菌雙人超凈臺，浙江孚夏醫療科技有限公司；SMZ168體式顯微鏡，麥克奧迪科技有限公司；PCR max Eco 48 熒光定量PCR儀，上海睿玥實驗器材有限公司。

2 結果與分析

2.1 Cps對線衰老指標的影響

壽命實驗結果證實，Cps能夠顯著延長野生型N2線蟲的壽命，質量濃度為0.1 mg/mL時效果最佳(圖1-A)，但對飲食限制信號通路突變體線蟲eat-2的壽命無明顯影響(圖1-B)，Cps顯著增加N2線蟲的蟲體擺動次數(圖1-C、1-D)、產卵量(圖1-E、1-F)和吞咽頻率(圖1-G、1-H)。

A-N2線蟲壽命實驗；B-突變體線蟲壽命實驗；C～D-線蟲擺動實驗；E～F-線蟲生殖實驗；G～H-線蟲吞咽頻次試驗圖1 酸漿宿萼水提物對N2線蟲壽命和生理功能的影響Fig.1 Effects of Cps on the life span and physiological function of N2 worms注：*代表P<0.05;**代表P<0.01；***P<0.001(n≥30)(下同)

2.2 Cps對野生型N2線蟲應激能力的影響

線蟲暴露于含有胡桃醌的培養基或者紫外輻射和高溫等不利環境中時，能夠導致線蟲體內活性氧自由基水平急速上升，造成氧化所傷，導致線蟲死亡[21]。因此，可通過觀察Cps對野生型線蟲N2在上述條件下存活時間的影響評價其抗氧化生物活性。實驗結果表明，0.1 mg/mL Cps具有顯著的抗氧化作用，能夠減少200 μmol/L胡桃醌(圖2-A)、紫外輻射(圖2-B)和熱應激(圖2-C)所誘導的氧化損傷，延長N2線蟲存活時間，具有顯著的體內抗氧化生物活性。

A-氧化應激實驗；B-紫外輻射實驗；C-熱應激實驗圖2 Cps對N2線蟲應激能力的影響Fig.2 Effects of Cps on stress ability of N2 worms

2.3 Cps對突變體線蟲抗氧化應激能力的影響

突變體線蟲氧化應激實驗結果表明，Cps能夠顯著增加線粒體信號通路突變體線蟲clk-1(圖3-A)和胰島素信號通路突變體線蟲daf-2(圖3-B)的抗氧化應激能力，延長其存活時間，但是對飲食限制信號通路突變體線蟲eat-2的存活時間無明顯影響 (圖3-C)。

2.4 Cps對線蟲體內氧自由基的水平影響

為了進一步探究Cps對線蟲體內氧自由基水平的影響，采用綠色熒光染料2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA )對線蟲體內的活性氧自由基進行染色，評價線蟲體內活性氧自由基的水平。實驗結果表明，給藥組線蟲熒光強度顯著低于對照組，Cps能夠顯著降低線蟲體內活性氧自由基的水平(圖4)。

A-實時熒光檢測實驗；B-熒光總強度差異性分析圖4 Cps對線蟲體內氧自由基水平的影響Fig.4 Effects of Cps on the level of oxygen free radicals in the worms

2.5 Cps對經典抗氧化酶和靶基因轉錄水平的影響

實驗結果證明，Cps能夠顯著提高超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)的活性以及經典抗氧化基因gst-4、gst-7、sod-3、daf-16的轉錄水平(圖5)。

A-SOD和CAT酶活力檢測實驗；B-qPCR實驗結果圖5 Cps對抗氧化酶和基因轉錄水平影響Fig.5 Effect of Cps on the antioxidant enzyme and gene of worms

2.6 Cps對大腸桿菌OP50(尿嘧啶缺陷型大腸桿菌(Escherichia coli OP50)增殖的影響

通過菌增殖實驗檢測了0.1 mg/mL的酸漿宿萼水提物對線蟲食物大腸桿菌OP50增殖的影響，如圖6所示，0.1 mg/mL的酸漿宿萼水提物對大腸桿菌OP50增殖無影響。

圖6 大腸桿菌生長曲線Fig.6 Growth curve of Escherichia coli OP50

3 討論

高水平的活性氧是有氧代謝的副產物，會破壞許多大分子，如DNA、脂類和蛋白質。活性氧的產生和清除之間的不平衡使各種氧自由基逃逸并破壞許多大分子。這種損傷被認為會導致生理功能的加速下降和死亡風險的增加。因此，合理采用藥物干預生物體內的自由基水平成為延緩衰老的途徑之一。

本實驗采用秀麗隱桿線蟲為模式動物系統探究酸漿宿萼水提物對線蟲衰老的影響。同空白對照組相比，酸漿宿萼水提物能夠顯著延長野生型線蟲N2的壽命，增加線蟲產卵數目和吞咽頻率，體現出顯著的抗衰老作用。同時，能夠顯著提高線蟲抗氧化應激能力，降低來自胡桃醌、紫外輻射和熱應激所誘導的氧化損傷和線蟲體內活性氧自由基的水平，提高SOD和CAT活力，體現出顯著的體內抗氧化生物活性。這一結果同“自由基學說”相吻合，推測其抗衰老作用源于其所具有的體內抗氧化生物活性相關。同時，在突變體線蟲壽命和氧化應激實驗中，Cps不影響飲食限制信號通路突變體線蟲eat-2的壽命和抗氧化應激能力，進一步證明Cps的抗衰老生物活性同飲食限制信號通路相關。在已有研究中，飲食限制信號通路的激活將會上調相關抗氧化基因的轉錄水平，進而增強線蟲的抗氧化應激能力，延長線蟲的壽命[22-25]。本實驗中，Cps能夠顯著上調經典抗氧化基因gst-4、sod-3、daf-16和熱抗性基因hsp-16.2的轉錄水平，與已有研究結果相符。但是，已有研究表明，飲食限制信號通路的激活會導致線蟲產卵數目下降，產卵周期延長。然而在本實驗中，Cps顯著增加了線蟲產卵數目，對線蟲產卵周期無顯著影響，其原因可能是Cps不完全依賴于飲食限制信號通路，其他信號通路的激活導致了線蟲產卵數目的增加。此外，適當的饑餓同樣能夠激活飲食限制信號通路[26]，為此，實驗檢測了Cps對線蟲食物大腸桿菌OP50增值的影響，發現實驗濃度的Cps不影響大腸桿菌OP50的增值，證明Cps所體現出的生物活性同大腸桿菌OP50增值無關。

綜上，Cps(0.1 mg/mL)能夠延緩線蟲衰老，具有顯著的抗衰老作用，其作用機理可能通過激活飲食限制信號通路，上調相關抗氧化基因的轉錄水平，增強線蟲抗氧化應激能力，降低線蟲衰老過程中體內活性氧自由基的水平，進而減少氧化損傷，延長線蟲壽命。本文為酸漿宿萼的開發利用及生物活性進一步研究提供借鑒，為抗衰老藥物的研發提供數據支撐。