濃香型大曲中降解生物胺菌株的篩選及應用

曾玉雪，羅惠波,3，余東，黃丹,3，郭輝祥，鄒永芳*

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓，644000)2(舍得酒業股份有限公司， 中國生態釀酒產業技術研究院，四川 遂寧，629200) 3(釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000)

生物胺(biogenic amines，BAs)是一類低分子質量的含氮有機堿，具有脂肪族、芳香族和雜環結構[1]，是細胞內正常的活性成分[2]。游離氨基酸經脫羧酶作用和醛被胺化作用后生成生物胺，在胺氧化酶作用下被氧化降解[3-4]。微量的生物胺對身體有益，促進人體新陳代謝和生長發育，但過量攝入時胺氧化酶活性不足，將引發一系列疾病反應產生毒害作用，尤其解毒機制有缺陷的人易受到威脅[5-7]。常見的生物胺如組胺、酪胺、色胺和β-苯乙胺的中毒癥狀包括惡心、發熱、出汗、心悸和皮疹等[8]。

生物胺存在于各種食物中，如魚類、肉類、酒類等發酵制品及水產品等富含蛋白質和氨基酸的食品[9]。白酒生產原料中含有豐富的蛋白質，發酵過程中會被降解為游離氨基酸，在氨基酸脫羧酶的作用下會形成大量的生物胺，影響了白酒的安全性[10]。白酒中生物胺的相關研究較多。杜木英等[11]通過自動氨基酸分析研究白酒發酵過程中生物胺的動態變化，僅鑒定了少數生物胺。溫永柱等[12]利用液液萃取和氣相色譜-質譜聯用技術完成了白酒中生物胺的定性研究，首次在白酒中檢測出9種生物胺，腐胺、尸胺、甲胺、乙胺、吡咯烷、異戊胺、環己胺、環庚胺、環戊胺，采用反相高效液相色譜法進行定量分析，得出吡咯烷含量最高[13]。范文來等[14]發現改變酒醅發酵和蒸餾過程可以控制生物胺含量，以蛋白質含量較低的谷物作釀酒原料也能降低白酒中生物胺含量；另外，也可通過在發酵底物曲藥、酒醅中選擇無氨基酸脫羧酶活性或添加有胺氧化酶和胺脫氫酶活性的微生物來降低白酒中生物胺的含量[15]。

食品中生物胺的控制方法主要有輻照、控制衛生及使用添加劑，在發酵食品中通過添加降解生物胺的微生物從而降低其生物胺含量的方法愈來愈受重視。目前已報道的文章主要是從泡菜[16]、臭豆腐[17]、豆瓣醬[18]以及發酵肉制品[19]篩選出具有降解生物胺的菌株，而關于酒曲中降解生物胺菌株的研究很少。因此，從酒曲中篩選出降解生物胺的菌株，對生產出更健康安全的酒產品具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 培養基

YPD瓊脂培養基：1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂(均為質量分數)。

YPD肉湯培養基：1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖(均為質量分數)。

YPD小麥浸提液培養基：150 g小麥用1 L去離子水浸泡過夜，煮沸60 min，4層紗布過濾得到小麥浸提液，按YPD肉湯培養基配方配制YPD小麥浸提液培養基，分裝，250 mL三角瓶的裝液量為50 mL，滅菌冷卻。

1.1.2 化學試劑

腐胺鹽酸鹽、尸胺鹽酸鹽、甲胺鹽酸鹽、乙胺鹽酸鹽、吡咯烷、異戊胺、環己胺、環庚胺(純度均>98%)、丹磺酰氯(dansyl chlorie,DNSCI)，美國sigma公司；環戊胺(純度為98%)，日本TCI公司；乙腈、甲醇(均為色譜級)、丙酮、乙醚(均為分析純)，成都市科隆化學品有限公司；氯化鈉、碳酸氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸(均為分析純)，天津市致遠化學試劑有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司；超純水，由電阻率為18.25 Ω的儀器制備。

1.1.3 儀器與設備

LEICA DM500型光學顯微鏡，德國Leica有限公司；1260 Infinity型高效液相色譜儀，美國Alilent有限公司；BF-2000M型氮氣吹干儀，青島科迪博電子科技有限公司；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；STARTER2100型酸度計，美國OHAUS儀器有限公司；BSC-400型恒溫恒濕箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；QL-902渦旋儀，海門市其林貝爾儀器制造公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物胺降解菌的篩選

1.2.1.1 生物胺降解菌的初篩

稱取25 g大曲樣品到225 mL無菌生理鹽水中，渦旋振蕩1 min；吸取25 mL上清液至225 mL無菌生理鹽水中，再依次吸取1 mL～9 mL無菌生理鹽水，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋液，然后在10-3、10-4、10-5、10-6分別吸取100 μL至YPD瓊脂培養基中進行涂布，28 ℃培養24 h。挑取不同菌落形態、大小、質地、顏色、透明度、生長位置的單菌落，以平板劃線法反復分離純化，直至得到純菌落，菌株斜面保藏于4 ℃，用于生物胺的降解研究。

1.2.1.2 生物胺降解菌的復篩

將大曲中篩選的微生物斜面于28 ℃活化24 h，添加9 mL無菌生理鹽水制成菌懸液，血球計數板調整菌濃至數量級為106個/mL，接種至含有腐胺、尸胺、甲胺、乙胺、吡咯烷、異戊胺、環己胺、環庚胺、環戊胺100 mg/L的50 mL YPD液體培養基中，接種量為6%，接種菌株為樣品組，不接種菌株為空白對照組，按酵母菌一般特性設置培養條件，28 ℃、180 r/min培養2 d。采用高效液相色譜法測定其生物胺的含量，選出生物胺降解率最高的菌株，降解率計算如公式(1)所示:

(1)

1.2.2 生物胺含量的測定

采用外標法測定生物胺含量，生物胺標準溶液及相關試劑的配制參考GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測定》[20]。

1.2.2.1 標準曲線的制作

按1 000 mg/L稱取一定量的生物胺配制標準溶液，然后分別吸取1 mL各生物胺單組分標準儲備溶液，置于同一個10 mL的容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容，配成100 mg/L的生物胺標準混合使用液。生物胺標準混合使用液進行梯度稀釋，質量濃度分別為80、60、40、20、10、5 mg/L，得到生物胺標準系列溶液。

1.2.2.2 發酵液中生物胺含量的測定

衍生方法參考GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測定》[20]和 FRAS等[21]并稍作改動。取1 mL生物胺標準系列溶液于15 mL離心管中，依次加入1 mL飽和碳酸氫鈉溶液，1 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液提供一個堿性環境，1 mL 10 mg/mL DNSCI溶液，渦旋混勻1 min，于40 ℃恒溫水浴具塞暗處理30 min，15 min搖勻1次，取出，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，40 ℃恒溫10 min以終止衍生化，取出冷卻至室溫，加入3 mL×2次乙醚，振蕩2 min，靜置分層后轉移上層有機相至新的15 mL離心管，合并2次萃取液，40 ℃水浴氮氣吹干。加入1 mL乙腈溶解殘留物，振蕩混勻后，過0.22 μm濾膜，待測定。

1.2.2.3 生物胺標準系列溶液的柱前衍生

樣品前處理：取5 mL發酵液于15 mL離心管中，6 000×g離心20 min。取1 mL上清液衍生處理，同標品。

1.2.2.4 高效液相色譜條件

色譜條件參考陳智毅等[22]的方法，并稍作修改，色譜柱為Angilent ZORBAX SB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，紫外檢測波長254 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，流速0.4 mL/min，流動相A乙腈、B超純水，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program list

1.2.3 生物胺降解菌的鑒定

1.2.3.1 生物按降解菌的形態學鑒定

觀察菌落顏色、大小、形態、質地、透明度、邊緣整齊性、表面光滑性等，光學顯微鏡觀察細胞形態，根據《酵母菌的特征與鑒定手冊》[23]確認其為酵母菌。

1.2.3.2 生物胺降解菌的分子生物學鑒定

提取降解率最高的菌株基因組DNA的方法參考文獻[24]所述并稍作改動，擴增引物為：NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′；NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′，進行16S rDNA擴增，PCR程序條件為：94 ℃預變形4 min后進入以下循環，94 ℃變形45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；70 ℃修復延伸10 min，40 ℃終止反應。擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序后，將所得序列在NCBI數據庫進行BLAST序列對比，構建菌株系統發育進化樹。

1.2.4 生物胺降解菌的生長特性研究

1.2.4.1 溫度耐受性

(1)菌種斜面于28 ℃活化24 h后，用9 mL無菌生理鹽水制成菌懸液，血球計數板計數并調整菌濃至1×106CFU/mL，按三角瓶裝液量的6%接種至無菌小麥浸提液配制的YPD液體培養基，8層紗布封口；

(2)設置培養溫度為25、30、35、40、45 ℃，于180 r/min 恒溫振蕩器培養48 h，再于YPD瓊脂培養基平板上活菌計數，確定菌株奧默柯達酵母(Kodamaeaohmeri，HJM)的最高耐受溫度。

(3)若在已設置培養溫度中沒有得到其具體耐受溫度，則縮小溫度范圍繼續試驗。

1.2.4.2 乙醇耐受性

小麥浸提液配制YPD液體培養基，裝液量為50 mL，滅菌后于無菌環境下加入乙醇，體積分數為6%、8%、10%、12%、14%，按體積分數6%的接種量接入菌液，然后在28 ℃、180 r/min培養48 h后平板活菌計數，確定HJM的最高耐受乙醇濃度。

1.2.4.3 酸耐受性

小麥浸提液配制YPD液體培養基，裝液量為50 mL，用乳酸調節pH值為2、3、4、5、6，滅菌后按6%的接種量接入菌液，28 ℃、180 r/min培養48 h后平板活菌計數，確定菌株HJM的最高耐酸pH。

1.2.4.4 糖耐受性

小麥浸提液配制YPD液體培養基，裝液量為50 mL，酵母直接利用葡萄糖，因此加入葡萄糖調節糖質量濃度為100、200、300、400、500、600 g/L，滅菌后按6%的接種量接入菌液，28 ℃、180 r/min培養48 h后平板活菌計數，確定菌株HJM的最高耐受糖濃度。

1.2.5 生物胺降解菌在固態發酵條件下對生物胺的降解

酵母的最適生長溫度是28～30 ℃，本實驗室監測濃香型大曲生產中溫、濕度的變化趨勢，發現28 ℃左右時對應濕度為90%左右[25]，在實驗室條件下以小麥為固態發酵基質測定該菌對生物胺的降解能力。稱取一定量小麥，5%(質量分數)水進行潤料4 h，粉碎呈2、4、6瓣，加入20%(質量分數)水，拌勻，以100 mg/L分別加入9種生物胺，再按5%的接種量加入菌液，以不添加菌液作對照，研究菌株HJM固態發酵條件下對生物胺的降解率，通過生長特性研究得到其最適生長溫度，恒溫恒濕培養2 d后測定其生物胺含量。另外，相同方法制作小麥固態發酵基質，不外加生物胺相同條件下培養2 d，以研究其本身是否含有生物胺。

發酵完成后，取10 g發酵樣品到100 mL三角瓶中，加入20 mL 5%(質量分數)三氯乙酸溶液，30 ℃ 200 r/min 振蕩30 min，轉移上清液到50 mL容量瓶，重復1次，最后用5%三氯乙酸定容，取1 mL衍生，方法同標品。

1.3 數據分析

所有試驗數據均使用 SPSS Statistic 25.0 軟件進行分析，采用 Origin 2019b軟件進行繪圖，使用鄧肯氏多重比較在5%水平下評估樣品間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 生物胺標曲制作

采用高效液相色譜法測定生物胺含量，單標定性，混標定量，得到9種生物胺標準品混合液相色譜圖，如圖1所示。

1-甲胺；2-乙胺；3-環戊胺；4-腐胺；5-環己胺；6-尸胺； 7-環庚胺；8-異戊胺；9-吡咯烷圖1 九種生物胺標準品混合液相色譜圖Fig.1 The mixed liquid chromatogram of 9 biological amines standard

9種生物胺的不同濃度采用高效液相色譜法測定其峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作標準曲線，回歸方程及相關系數如表2所示。9種生物胺在5～80 mg/L線性關系良好，相關系數均>0.99。

2.2 生物胺降解菌的篩選

從大曲中篩選出16株菌，編號為J1～J16，對其進行9種生物胺降解研究，其中J1～J9這幾株菌的降解情況略好，其降解率如表3所示，編號為J5的菌株降解的生物胺種類最多，只有尸胺和環庚胺濃度在檢測限以下無法測出，其生物胺降解率也顯著高于其他菌株(P<0.05)，其中對環己胺的降解效果最好，降解率達38.07%。因此，選擇編號為J5的菌株進行后續試驗研究。

表2 九種生物胺的回歸方程和相關系數Table 2 Regression equations and R2 of 9 biogenic amines

表3 菌株對生物胺的降解率 單位：%

2.3 生物胺降解菌的鑒定

2.3.1 生物胺降解菌的形態學鑒定

編號為J5的菌株對生物胺的降解效果最好，其在YPD瓊脂培養基上的菌落形態和光學顯微鏡及電鏡掃描下的細胞形態特征如圖2所示。菌落呈圓形、顏色略黃、不透明、表面光滑、邊緣整齊，但在斜面培養時間過長，其邊緣會出現褶皺狀；其菌體呈圓形，出芽繁殖。

a-菌落形態;b-光學顯微鏡圖;c-電鏡圖圖2 酵母菌J5的形態學特征Fig.2 Morphological characteristics of strain J5

2.3.2 生物胺降解菌的分子生物學鑒定

提取編號為J5的菌株基因組DNA，通過PCR擴增得到J5的16S rDNA序列，測序得到序列長度為498 bp。將該菌株16S rDNA的測序結果在NCBI GeneBank中BLAST核酸庫進行對比，得到該菌株與Kodamaeaohmeriisolate K68的同源性高達100%。該菌株與模式菌株GU597323.1及其他近源菌株的16S rDNA構建系統發育進化樹如圖3所示，得到其與序列號為MK414670.1的奧默柯達酵母(K.ohmeri)的距離最近。因此，可初步確定編號為J5的菌株為奧默柯達酵母，將其命名為K.ohmeriHJM。

圖3 菌株J5的系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain J5

2.4 K.ohmeri HJM的生長特性研究

K.ohmeriHJM在不同條件下的生長狀況如圖4所示。由圖4-a可知，K.ohmeriHJM在30 ℃時生長最好，與其他溫度差異極顯著(P<0.01)，40 ℃生長減少，45 ℃時停止生長。須在此范圍之間繼續試驗，才可得其最高耐受溫度。繼續試驗得到43 ℃時，菌株少量生長，44 ℃時不再生長，即得到K.ohmeriHJM的最高耐受溫度為43 ℃。

由圖4-b可知，隨著乙醇濃度增加菌株生長總數減少，乙醇體積分數為12%時，菌株生長較少，14%時停止生長。繼續試驗得乙醇體積分數為13%時，只有少許菌株生長，即得K.ohmeriHJM的最高耐受乙醇體積分數為14%。

由圖4-c可知，pH值為6時菌株生長情況最好，隨著環境酸度增加菌株生長總數減少，pH值為3時有少許菌株生長，pH值為2時菌株停止生長，即得K.ohmeriHJM最高耐酸pH值為2。表明K.ohmeriHJM在過酸環境下生長受到抑制，但具有一定耐酸性，在酸性環境下能生長。

由圖4-d可知，隨著葡萄糖濃度的增加菌株生長減少，500 g/L時相對減少，但其總數依然有2.95×108CFU/mL，生長狀況良好。600 g /L時，依然有很多菌株生長，即得到K.ohmeriHJM有較高的糖耐受性。

圖4 不同條件對K.ohmeri HJM生長的影響Fig.4 The effect of different conditions on the growth of K.ohmeri HJM

2.5 K.ohmeri HJM在固態發酵中的應用

2.5.1 小麥固態發酵基質中生物胺的含量

研究K.ohmeriHJM的溫度耐受性，于25～30 ℃ 分別培養48 h計數，得到其最適生長溫度為28 ℃。制作小麥固態發酵基質，不添加生物胺不接種菌液，于28 ℃、90%下培養2 d，測定其生物胺含量，結果如表4所示。可得到小麥基質中含有一定量生物胺，其中吡咯烷含量最高，達到133.89 mg/kg，這與溫永柱等[13]研究的白酒中吡咯烷含量最高一致。

表4 小麥發酵基質中生物胺的含量 單位:mg/kg

2.5.2 生物胺降解菌在小麥基質中對生物胺的降解

小麥固態發酵基質中含有一定量生物胺，但為更好地表征K.ohmeriHJM在固態發酵條件下對生物胺的降解能力，向小麥基質中添加生物胺，接種菌液相同條件下進行發酵，測定其生物胺含量如圖5所示。與未添加生物胺的小麥固態發酵基質中生物胺的含量一致，吡咯烷含量最高，其次是環戊胺。樣品組中的生物胺含量顯著低于空白組，尤其是吡咯烷和環己胺，二者樣品組合空白組中的含量有極顯著差異，表明K.ohmeriHJM在固態發酵條件下降解生物胺的效果較好。

圖5 固態發酵條件下樣品中生物胺的含量Fig.5 The contents of biogenic amines in samples under solid-state fermentation conditions注：“*”表示樣品組與空白組相比有顯著差異(P<0.05)， “**”表示與空白組相比有極顯著差異(P<0.01)

K.ohmeriHJM在固態發酵條件下對不同生物胺的降解率如表5所示。環庚胺在檢測限以下無法測出，除此之外，其他幾種生物胺的降解率多在30%以上，對環戊胺的降解能力最強，降解率達到66.07%，其次是吡咯烷的降解率達到63.42%。固態發酵條件下，K.ohmeriHJM對生物胺的降解效果比在液態環境中更好，這可能是因為K.ohmeriHJM在固態環境中利用小麥基質中的營養生長更旺盛，能更好地發揮作用降解生物胺。

3 結論

該研究從大曲中分離出16株酵母菌，將其接種到含有9種生物胺的小麥浸提液配制的YPD液體培

表5 K.ohmeri HJM在固態發酵中對生物胺的降解率 單位：%

養基培養48 h，對其進行生物胺降解研究，得到1株降解效果最好的編號為J5的酵母菌。對其進行形態學和分子生物學鑒定，得到其為奧默柯達酵母(K.ohmeri)，將其命名為K.ohmeriHJM。在固態發酵條件下，不添加生物胺不接種菌液，直接將小麥發酵基質進行培養，測定其中含有一定量的生物胺，吡咯烷含量最高。將奧默柯達酵母接種到小麥固態基質進行培養，以未接菌種為空白對照，得到其對幾種生物胺的降解率分別為腐胺(39.19±0.08)%、尸胺(33.77±0.06)%、甲胺(32.44±0.06)%、乙胺(23.39±0.06)%、吡咯烷(63.42±0.02)%、異戊胺(49.83±0.07)%、環己胺(49.73±0.03)%、環戊胺(66.07±0.08)%，尤其對環戊胺、吡咯烷的降解效果很好。

該菌株對腐胺、尸胺、甲胺、吡咯烷等都有較好的降解效果，可以降低以小麥為原料制作的酒曲中生物胺的含量，在白酒釀造中曲藥的意義重大，因此降低曲中生物胺含量可為安全生產白酒提供保障。本研究從大曲中分離出降解生物胺的菌株，可為白酒中生物胺的調控提供一定參考價值。另外，對K.ohmeriHJM進行生長特性研究，得到其具有較高的耐糖性、耐酸性和耐乙醇性，推測其在白酒釀造的酸性環境中亦能較高效地降解生物胺。