羊乳巴氏殺菌條件的篩選

葉彤，聶聰怡，李林強

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安，710119)

羊乳被稱為“乳中之王”[1]，優質蛋白含量豐富，含有顆粒較小的球蛋白，易被人體消化吸收，且羊乳酪蛋白和乳清蛋白的比例接近母乳，較其他乳源對人體健康更有利[2-4]。乳的熱處理主要包括預熱、殺菌甚至滅菌等過程。巴氏殺菌是最常見的熱處理方式，其主要目的是殺滅乳品中大多數微生物，保證乳品的品質和延長乳品的貨架期[5-6]，改善乳品加工性能[7]。低溫巴氏殺菌對乳中熱不穩定性蛋白的影響較小[8]，而高溫巴氏殺菌則會導致乳品蛋白的乳化能力和穩定性發生較大的變化[9-10]。因此，低溫的巴氏殺菌是更受人們青睞的熱加工方式。

蛋白質的水解是羊乳殺菌過程中發生的主要化學變化之一。在加工生產方面，水解后的乳蛋白往往更有利于發酵乳制品的生產[11]；在健康方面，蛋白質水解后產生的小分子肽及氨基酸更容易被人體吸收，且部分小肽還具有調節血糖[12]、抗氧化[13]、抗高血壓[14]、抑菌[15]等功能；在安全方面，巴氏殺菌后的乳蛋白相比未處理而言更加安全，如經過65～100 ℃加熱處理后，α-乳白蛋白的抗原性和潛在致敏性顯著降低[16]。目前，對于乳蛋白的水解有相當多的研究，但多集中于酶對蛋白質的水解。馬瑩等[17]報道胃蛋白酶水解乳清蛋白最佳酶解工藝溫度為37 ℃，胰蛋白酶水解乳清蛋白最佳酶解溫度為55 ℃，韓仁嬌等[18]報道在55.2 ℃條件下，β-乳球蛋白酶解產生乳清水解蛋白，其水解率可達60%。但是酶處理易導致蛋白質過度水解，產生大量苦肽和游離氨基酸，影響羊乳的風味。巴氏殺菌是一種常見的殺菌方式，并且廣泛應用于工業生產實踐，但是當下不同企業采用不同的巴氏殺菌條件，主要體現在巴氏殺菌時間和殺菌溫度的不同，雖然這些條件滿足了商業殺菌的要求，但是哪一種巴氏殺菌的條件更有利于保護乳蛋白的特性，尚缺乏系統的研究。

本文較系統地研究巴氏殺菌對羊乳水解程度、色值變化、表面形貌、蛋白種類的影響，以加深人們關于巴氏殺菌對羊乳蛋白質性狀影響的認識，有利于深入研究羊乳品質的穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

鮮羊乳采自陜西省西安市長安區關中奶山羊養殖場，冰盒2～4 ℃運回實驗室。

1.1.2 主要試劑

牛血清白蛋白，上海藍季科技發展有限公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、丙烯酰胺、考馬斯亮藍R-250、考馬斯亮藍G-250，N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、N,N,N,N-四甲基乙二胺，Sigma公司；鹽酸、過硫酸銨、溴酚藍、甘氨酸，上海源葉生物試劑有限公司；甘油、冰醋酸、95%(體積分數)乙醇、氯化鈉、磷酸、乙醚(均為國產分析純)，天劍天利化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設備

800B臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；J探頭原子力顯微鏡，Veeco Bruker公司；SC-80C全自動色差儀，北京康光光學儀器有限公司；PowerPac TM Universal電泳系統、Universal Hood II,XRS凝膠成像系統，美國Bio-rad公司。

理論、計算與實際應用在現行數學標準與教材中的割裂狀態應當改變，兩者必須結合起來.小學數學中的理論和計算技能，如果學生不懂得如何應用于實際問題，則無價值可言.

1.2 實驗方法

1.2.1 羊乳中蛋白質含量的測定

乳中蛋白質含量的測定參考文獻[19]的方法。稱量0.1 g牛血清白蛋白至100 mL容量瓶中,倒入0.15 mol/L的NaCl溶液至刻度線，混勻配制成1.0 mg/mL 的標準蛋白溶液。依次吸取標準蛋白溶液(0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mL)和0.15 mol/L的NaCl溶液(0.09、0.08、0.07、0.05、0.04 mL)于相應試管中，再分別加入考馬斯亮藍G-250試劑各5.00 mL。采用722型可見分光光度計在595 nm處測定其吸光度。以牛血清白蛋白標準溶液質量濃度(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL)為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制蛋白質含量測定的標準曲線。準確移取1 μL羊乳于試管中，再加入99 μL NaCl溶液，其余操作同上。

1.2.2 不同巴氏殺菌羊乳色值的測定

采用全自動色差儀測定不同巴氏殺菌條件下羊乳的紅值(a*)、黃值(b*)和亮度(L*)，以常溫鮮羊乳為對照。

1.2.3 羊乳蛋白粒子形貌原子力顯微鏡觀察

取等量常溫和95 ℃，15 s處理的羊乳，經400×g離心15 min后，棄去脂肪層，再使用乙醚萃取，脫去剩余殘脂。對少量脫脂后的羊乳稀釋25倍后，進行超聲處理。取樣液鋪展在云母片上,靜置風干。制備好的蛋白云母片樣本在Bruker原子力顯微鏡J探頭下進行掃描觀察。

1.2.4 巴氏殺菌羊乳蛋白質十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析

參考文獻[20]稍作修改。取2 mg不同溫度處理的羊乳和對照乳,分別溶解在1 mL樣品緩沖液中。配制濃縮膠的體積分數為5%，配制分離膠的體積分數為13%。將分離膠注入凝膠板至距上部1/4處，再灌入蒸餾水壓平，待凝固后倒掉蒸餾水。然后注入濃縮膠，插入梳子后等待凝固。倒入電泳緩沖液至沒過凝膠板，拔梳子。樣品上樣量為10 μL。將濃縮膠中的電壓控制為80 V恒定，待溴酚藍條帶跑入分離膠后，電壓改為121 V，恒壓直到蛋白質染液跑至距分離膠底部1 cm左右處,關閉電源停止電泳。將凝膠片放入考馬氏亮藍染液染色，置于搖床振蕩2 h。再放入脫色液脫色，每2 h換1次，至背景通透、蛋白條帶可清楚辨別。

2 結果與分析

2.1 考馬斯亮藍法蛋白質含量測定標準曲線方程的建立

以牛血清白蛋白標準溶液質量濃度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL)為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。依據各個濃度對應的吸光值點進行線性回歸，建立標準方程。結果顯示回歸方程為y=0.908 4x-0.017，其線性范圍為0～0.6 mg/mL，該方程的R2=0.991 9，表明蛋白質標準曲線濃度與吸光度關系良好，該方程可信度高(P<0.01)。

2.2 不同巴氏殺菌羊乳中蛋白質含量

采用考馬斯亮藍法對65、75、85、95 ℃巴氏殺菌乳中的蛋白質含量進行測定。由圖1可知，各巴氏殺菌處理組的羊乳總蛋白質含量均顯著高于對照組(25 ℃未經處理的羊乳，下同)(P<0.05)，考馬斯亮藍法的測定原理是蛋白質和色素的結合，但肽類物質也可以與色素結合，這可能是處理組蛋白質的含量高于對照組的原因，也進一步表明蛋白質在75 ℃以上溫度時發生了水解；75 ℃巴氏殺菌乳中的蛋白質含量顯著高于其他巴氏殺菌組(P<0.05)；85和95 ℃巴氏殺菌乳中的蛋白質含量顯著高于65 ℃巴氏殺菌組(P<0.05)；85和95 ℃巴氏殺菌羊乳中的蛋白質含量無顯著差異(P>0.05)。

圖1 羊乳蛋白質含量在不同溫度處理30 min后的變化Fig.1 The contents of protein from goat milk treated at different temperatures for 30 min

對95 ℃加熱15 s、30 min和4 h的巴氏殺菌乳中的蛋白質含量測定結果如圖2所示，各巴氏殺菌組的羊乳蛋白質含量均顯著高于對照組(P<0.05)。15 s巴氏殺菌乳中的蛋白質含量顯著高于其他巴氏殺菌組(P<0.05)。4 h巴氏殺菌乳中的蛋白質含量顯著高于30 min巴氏殺菌組(P<0.05)。

圖2 羊乳蛋白質含量在95 ℃不同時間處理后的變化Fig.2 The contents of protein from goat milk treated at 95 ℃ for different times

結果表明，隨著在相同時間的處理條件下溫度的升高，蛋白質含量先增大，后降低。這可能是因為隨著溫度升高，羊乳蛋白空間構象改變，二三級結構和疏水區域發生變化，蛋白質的酶切位點數量增加，因此巴氏殺菌后的乳蛋白對蛋白酶更加敏感，而羊乳中蛋白酶、纖溶酶等內源水解酶會降解乳中蛋白質，將其分解為小分子短肽和游離氨基酸[21-22]。相對于75 ℃條件的巴氏殺菌，85、95 ℃的巴氏殺菌溫度較高，可能致使某些特殊蛋白質發生一定凝結，從而表現為蛋白質含量下降。而在65 ℃處理后的羊乳蛋白含量較其他處理組最低，可能是由于耐熱蛋白酶的最佳酶解溫度主要集中于60～80 ℃，少數例外也在80 ℃以上[23]，因此水解酶的活性未完全激活。在95 ℃不同時間的處理下，處理15 s后羊乳蛋白質含量相對其他處理組最高，這可能是由于在此條件下蛋白水解程度較大，產生了較多游離氨基酸和小肽導致的。

2.3 不同巴氏殺菌對羊乳色澤的影響

采用全自動色差儀對65、75、85和95 ℃巴氏殺菌乳中的蛋白質色值進行測定。由表1可知，65、75、85、95 ℃處理的羊乳b*顯著高于對照組(P<0.05)，4組處理組之間也均具有顯著性差異(P<0.05)。隨著溫度的增加，羊乳的b*值呈逐漸增大的趨勢，在75 ℃時，羊乳的b*值相對于其他處理組最低。這說明褐變現象最明顯的為95 ℃處理組，接下來依次為85、65、75 ℃處理組。而各巴氏殺菌的L*，a*，c*，H則無顯著規律變化(P>0.05)。綜上結果表明，在不同溫度處理30 min，羊乳b*值的大小與處理溫度的高低呈一定程度的正相關。

表1 不同巴氏殺菌對羊乳色澤的影響Table 1 Effects of different heat treatments on goat milk color values

色值變化體現了美拉德反應的程度。本文研究結果表明75 ℃以上，隨著溫度的增加，羊乳的b*值呈逐漸增大的趨勢。這可能是由于在高溫條件下，乳糖降解產生還原性單糖，其羰基與乳蛋白的氨基相互作用發生美拉德反應，生成中間產物羥甲基糠醛，進一步積累形成類黑色素，且隨著加熱時間和加熱溫度的增加，褐變程度增大[24]。這與孫靜麗[25]、李思寧等[26]研究結果相一致。因此，黃值也可作為巴氏殺菌對羊乳品質影響的重要指標之一。

2.4 羊乳蛋白粒子形貌原子力顯微鏡觀察

采用原子力顯微鏡對巴氏殺菌(95 ℃，15 s)處理乳進行蛋白質粒子形貌觀察。如圖3、表2、表3所示，95 ℃，15 s 巴氏殺菌處理組蛋白的顆粒數目(77)顯著低于對照組(437)(P<0.05)，蛋白的顆粒密度(3.08個/μm2)顯著低于對照組(17.48個/μm2)(P<0.05)，蛋白的顆粒直徑(93.91 nm)大于對照組(80.41 nm)，蛋白的片狀凝聚程度(8 221.42 nm2)顯著高于對照組(5 636.28 nm2)(P<0.05)，而且蛋白質顆粒表面的起伏程度(5.92～23.79 nm)大于對照組(2.54～16.92 nm)。

a-常溫(25 ℃)；b-巴氏殺菌(95 ℃，15 s)圖3 常溫(25 ℃)和巴氏殺菌(95 ℃,15 s)處理后羊乳 蛋白質粒子的表面形貌Fig.3 Surface morphology of protein particles from goat milk treated at room temperatire(25 ℃) and 95 ℃ for 15 s

結果表明，巴氏殺菌后羊乳蛋白質粒度大于常溫(25 ℃)對照組羊乳。這可能是由于加熱導致羊乳蛋白的結構改變。巴氏殺菌后的羊乳表面有較大的凝聚顆粒，可能是因為高溫導致蛋白質分子內部肽鏈運動加劇，β-乳球蛋白與K-酪蛋白、α-乳白蛋白等的空間結構改變，導致蛋白質分子間形成二硫鍵[27]，結合成直徑更大的蛋白顆粒，由于這種結合方式下蛋白質空間排布不緊密，可能形成了疏松多孔結構，所以更多的小顆粒蛋白附著在羊乳酪蛋白表面，蛋白質粒子也會逐漸增大。另一方面，大分子蛋白質粒子數目在巴氏殺菌后大幅下降，這可能是由于在巴氏殺菌處理中，除部分含巰基蛋白質聚集外，還有部分其他的蛋白質在該溫度下發生大量水解，形成小分子氨基酸，使得大分子蛋白質粒子數目明顯降低。與李子超等[28]、楊楠[29]、CORREDIG等[30]和KAZMIERSKI等[31]研究結果類似，并且這種結果與上文熱處理對羊乳蛋白水解程度的影響分析結果一致。

表2 常溫(25 ℃)對照組羊乳蛋白質粒度

表3 巴氏殺菌(95 ℃，15 s)羊乳蛋白質粒度Table 3 Particle sizes of goat milk protein pasteurized at 95 ℃ for 15 s

2.5 巴氏殺菌羊乳蛋白質SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE對65、75、85和95 ℃巴氏殺菌乳中的蛋白質條帶進行分析。如圖4所示，各巴氏殺菌樣品均含有2條類似的蛋白條帶，但65、75 ℃巴氏殺菌組的A蛋白條帶灰度與對照組相近；85、95 ℃巴氏殺菌組的A蛋白條帶灰度明顯低于其他處理組，并且蛋白質條帶數目較75 ℃的巴氏殺菌處理組明顯減少。另外，65和75 ℃巴氏殺菌組的A蛋白條帶灰度無明顯差異；85和95 ℃巴氏殺菌組的A蛋白條帶灰度無明顯差異。

圖4 巴氏殺菌羊乳蛋白質SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of goat milk protein after pasteurization注：圖中條帶1, 2, 3, 4, 5分別代表對照、65、75、85、 95 ℃羊乳熱處理30 min

85、95 ℃巴氏殺菌的羊乳SDS-PAGE電泳灰度明顯變淺，表明隨著溫度的增高，羊乳蛋白水解程度增加。電泳條帶的灰度值與蛋白質分子的凝聚和交聯作用有關，形成這種現象的原因可能是高溫促進了蛋白質的水解，使蛋白質分解成更小分子肽和游離氨基酸，從而使條帶變淺。65和75 ℃處理的羊乳與對照組灰度無明顯差異，表明該溫度處理基本不會導致蛋白質的明顯水解，并且較85、95 ℃處理而言，65和75 ℃處理的羊乳蛋白質電泳條帶數目與對照組相比無明顯變化，也進一步證明上述結果。在75 ℃蛋白質條帶灰度的變化較小，因此在一定程度上這種溫度的處理可能更有利于保存蛋白質活性。

3 結論

巴氏殺菌是影響乳品加工品質的關鍵因素之一。本文研究表明巴氏殺菌會導致蛋白質含量、色值、表觀形貌的變化。巴氏殺菌的溫度和時間均對羊乳蛋白質的水解存在著顯著影響(P<0.05)。溫度增加容易導致蛋白質變性程度增加，表現為水解程度增大、羊乳褐變程度加深，進一步表現為75 ℃蛋白條帶無明顯變化，85、95 ℃蛋白質條帶減少、灰度變淺，并且95 ℃，15 s巴氏殺菌后的羊乳蛋白質數目減少、粒度增大。綜上所述，75 ℃，30 min的巴氏殺菌方法最適于羊乳的加工與生產，為羊乳的熱加工提供了參考。