一株可降解馬鈴薯淀粉汁水中蛋白質(zhì)菌株篩選與發(fā)酵產(chǎn)物分析

周慧寧，張一晟，張惠玲，李海峰

(寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川，750021)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是寧夏的戰(zhàn)略性主導(dǎo)產(chǎn)品之一，是寧夏南部山區(qū)脫貧致富的支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]，具有突出的區(qū)域優(yōu)勢(shì)和顯著的經(jīng)濟(jì)效益。隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，馬鈴薯淀粉加工業(yè)也在不斷壯大。調(diào)查顯示，寧夏南部山區(qū)有馬鈴薯加工企業(yè)近3 000家，年產(chǎn)量50 t以上的企業(yè)近200家，馬鈴薯淀粉廢水排放量近3 106 t[2]。由于直接還田灌溉后會(huì)自然發(fā)酵導(dǎo)致嚴(yán)重污染[3]。國內(nèi)外主要采用的常規(guī)處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法。綜合國內(nèi)外研究進(jìn)展進(jìn)行分析，采用物理化學(xué)法對(duì)馬鈴薯淀粉加工汁水進(jìn)行處理或?qū)χ械牡鞍走M(jìn)行回收，需要大型設(shè)備的支持以及場(chǎng)地的提供，需要消耗大量的試劑耗材，一些中小型工廠無法承受高昂的處理費(fèi)用，所以物理化學(xué)法具有一定的局限性[4]。生物處理法被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代污水處理,其特點(diǎn)為處理效率高、處理費(fèi)用低等,但是大部分菌種都需要在適宜的溫度環(huán)境下(30～40 ℃)進(jìn)行發(fā)酵，但淀粉生產(chǎn)具有季節(jié)性，主要集中在9、10月份，寧夏地區(qū)的氣溫較低(15 ℃左右)，不能滿足大部分菌種的生長條件，生物活性降低或喪失。所以，研究新的菌種來處理汁水污染問題已經(jīng)迫在眉睫。

實(shí)驗(yàn)利用微生物法，篩選1株能夠低溫降解馬鈴薯汁水中蛋白質(zhì)，但產(chǎn)生臭味很小的菌株，用于發(fā)酵馬鈴薯汁水，再將其還田灌溉，避免空氣污染，以達(dá)到處理廢水和生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的雙重目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料與儀器

土樣與馬鈴薯汁水，寧夏彭陽縣馬鈴薯汁水灌溉田和固原佳利源馬鈴薯淀粉廠；尸胺、腐胺、精胺、亞精胺(純度≥98.0%)，西格瑪奧德里奇；凝膠成像儀，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PCR儀，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、高效液相色譜儀，Agilent Technologies；全自動(dòng)氨基酸分析儀，日立；氮吹儀，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制[5]

富集培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨5，酵母浸粉5，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO41，NaCl 10，Na2CO310，pH 7.2；選擇培養(yǎng)基：選用酪蛋白培養(yǎng)基;種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母浸粉5，pH 7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的篩選

在250 mL錐形瓶中加入50 mL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的生理鹽水和幾粒玻璃珠，121 ℃滅菌15 min。稱取5 g土樣放入無菌生理鹽水中搖勻，制成土壤懸浮液。取1 mL土壤懸浮液加入50 mL到富集培養(yǎng)基中，20 ℃培養(yǎng)48 h，得一次增殖培養(yǎng)液[6-7]。重復(fù)上述操作，得到二次增值培養(yǎng)液。

液體水樣于20 ℃下恒溫發(fā)酵，發(fā)酵前期每8 h取樣，后期每12 h取樣，涂布于選擇培養(yǎng)基上[8]。固體土樣將二次增殖培養(yǎng)液用倍比稀釋法制成不同的稀釋度[9]。將兩者20 ℃培養(yǎng)，觀察有無透明圈出現(xiàn)，在菌落邊緣可以看到透明圈的菌株說明能夠降解酪蛋白[5]，即為初篩選菌株。取初篩獲得的菌株分別接種到馬鈴薯淀粉汁水中，20 ℃發(fā)酵。測(cè)定其發(fā)酵前后蛋白質(zhì)的降解情況，以及感官評(píng)價(jià)和揮發(fā)性物質(zhì)分析，選擇出氣味較低的菌株即為復(fù)篩選菌株。

1.2.2 低溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

對(duì)復(fù)篩得到的菌種活化擴(kuò)培，分別接種到馬鈴薯汁水中發(fā)酵，溫度為15 ℃，接種量為2%，pH值自然狀態(tài)進(jìn)行發(fā)酵。每隔48 h取樣，觀察菌體生長情況，測(cè)定其蛋白質(zhì)降解率，并通過感官評(píng)價(jià)和揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，選擇優(yōu)良菌株。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 菌株形態(tài)觀察及生理生化鑒定

參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]將目標(biāo)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.3.2 目的菌株16S rDNA序列分析

細(xì)菌基因組 DNA 的提取參照試劑盒的說明書進(jìn)行。利用細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增通用引物 27F和1492R[12]，以目的菌種基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用Colibri核酸純度測(cè)定儀測(cè)定DNA-50的濃度，并用1 %(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物純化后由上海生工生物工程有限公司測(cè)序，將得到的16S rDNA序列結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫并進(jìn)行BLAST比對(duì)，找到并下載典型的菌株序列與實(shí)驗(yàn)菌株的序列,用Clustal X 2.0軟件進(jìn)行同源性分析，并用 MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 生物胺的檢測(cè)

參考ZARGHAMPOUR等[13]的方法，利用高效液相色譜測(cè)定腐胺、尸胺、亞精胺、精胺的含量。由圖1得出3種生物胺在10 min內(nèi)得到了很好的分離，出峰時(shí)間依次是腐胺7.999 min，尸胺8.461 min，亞精胺8.877 min，精胺14.459 min通過標(biāo)準(zhǔn)品的時(shí)間來確定馬鈴薯淀粉汁水中生物胺的出峰時(shí)間。

1-腐胺；2-尸胺；3-亞精胺；4-精胺圖1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of bioamines

1.3.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定

馬鈴薯淀粉汁水中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》采用凱氏定氮法測(cè)定[14]。

1.3.3 氨基酸含量的測(cè)定

氨基酸組成的測(cè)定參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》[15]，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 吲哚與3-甲基吲哚的測(cè)定

參考孫翠香等[16]的方法，利用氣相色譜法快速測(cè)定馬鈴薯加工廢水中吲哚和3-甲基吲哚含量。

1.3.5 揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定

參考HE等[17]的方法設(shè)定固相微萃取條件。參考趙洪雷等[18]的方法設(shè)定氣相色譜條件，根據(jù)離子流圖計(jì)算各峰面積，按公式(1)計(jì)算揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量：

(1)

式中：m，揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量，%；A1，峰高，cm；A2，峰寬，cm；s，總面積，cm2。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解酪蛋白菌株的篩選

2.1.1 初篩結(jié)果

選用酪蛋白培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，從土壤和馬鈴薯淀粉汁水中共得到51株可降解酪蛋白的菌株，編號(hào)為1、2、44的菌株水解圈直徑D與菌落直徑d的比值[5]大于其余48株菌，見表1。

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果

51株菌分別進(jìn)行發(fā)酵復(fù)篩，發(fā)酵后汁水的揮發(fā)性物質(zhì)組成及其相對(duì)含量如表2、表3所示，雖然發(fā)酵后的汁水中均檢出有吲哚、硫化氫、3-甲基吲哚，但其含量的差距較大，1號(hào)菌株發(fā)酵后的汁水4種胺類物質(zhì)含量均為最小。1號(hào)菌的蛋白質(zhì)降解率達(dá)65.25%，其降解能力高于22號(hào)菌跟44號(hào)菌，見圖2。綜合比較，1號(hào)菌較為優(yōu)秀，但還需對(duì)該3株菌進(jìn)行低溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，選出在低溫下也能夠具有良好發(fā)酵性能的最優(yōu)菌株。

表1 51株蛋白質(zhì)降解菌在酪蛋白培養(yǎng)基上的降解能力Table 1 The degradation ability of 51 protein-degrading bacteria on casein culture medium

圖2 不同菌種對(duì)蛋白質(zhì)降解率的影響Fig.2 Effects of different strains on protein degradation rate

2.1.3 低溫發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

低溫發(fā)酵后，1號(hào)菌株對(duì)蛋白質(zhì)仍有較強(qiáng)的降解能力，降解率為61.43%，高于2號(hào)菌株和44號(hào)菌株，見圖3。相比復(fù)篩時(shí)20 ℃下的降解率有所降低，這是因?yàn)闇囟冉档停甑幕钚越档蚚19]，對(duì)其降解蛋白質(zhì)的能力有抑制作用。與自然發(fā)酵狀態(tài)下相比，硫化氫、吲哚、3-甲基吲哚有較大幅度的降低，見表4。各生物胺含量也比較低，尸胺最高為9.14 mg/L，亞精胺最低為2.37 mg/L，所以該菌株可用于馬鈴薯淀粉汁水中蛋白質(zhì)的降解。

圖3 不同菌株低溫發(fā)酵對(duì)蛋白質(zhì)降解率的影響Fig.3 Effect of low temperature fermentation of different strains on protein degradation rate

對(duì)發(fā)酵后的馬鈴薯淀粉汁水中氨基酸含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見表5，其含有豐富氨基酸資源，纈氨酸含量高達(dá)21.17 mg/L，苯丙氨酸含量13.14 mg/L，門冬氨酸11.798 mg/L，其中氨基酸分子可以被植物快速吸收，直接利用可以滿足灌溉時(shí)作為對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的需求，可使用該汁水進(jìn)行還田灌溉[20]，且不造成污染。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定圖

菌株J001在酪蛋白分離培養(yǎng)基上形態(tài)特征如圖4-a 所示，單個(gè)菌落中間凸起，不透明，邊緣不規(guī)則，大小為1～2.5 mm,呈紅色。顯微鏡下的形態(tài)如圖4-b 所示，鏡檢為近球型短桿狀，革蘭氏陰性，無莢膜，無芽孢。

表2 菌株復(fù)篩結(jié)果Table 2 Re-screening results of strains

表3 不同菌種發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量 單位：%

續(xù)表3

表4 低溫發(fā)酵后各主要物質(zhì)含量 單位：mg/L

表5 發(fā)酵后馬鈴薯淀粉汁水中各氨基酸含量 單位：mg/L

a-菌落形態(tài)；b-鏡檢圖片圖4 菌落形態(tài)特征圖Fig.4 The mrophological characteristics of the strain

2.2.2 生理生化鑒定

由表6可知，該菌株為革蘭氏陰性菌，吲哚、MR、淀粉還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性；VP、過氧化氫和硫化氫實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性。這些結(jié)果顯示1號(hào)菌株的生理生化特性與粘質(zhì)沙雷氏菌的各項(xiàng)生理生化特性都符合。

表6 生理生化鑒定表Table 6 Physiological and biochemical identification

2.2.3 菌株J001的16S rDNA鑒定

1號(hào)菌株電泳結(jié)果見圖5，經(jīng)比對(duì)，1號(hào)菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株NR044385.1在同一支系，相似度達(dá)99%，見圖6，故1號(hào)菌株初步鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)[21],起名為NXYS-S。

圖5 1號(hào)菌電泳結(jié)果Fig.5 J001pcr amplification electrophoresis

圖6 1號(hào)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 J001 strain phylogenetic tree

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)通過初篩、復(fù)篩，以蛋白質(zhì)降解率和揮發(fā)性氣體中的臭味物質(zhì)為指標(biāo)，篩選了1株可降解馬鈴薯汁水的菌株，該菌株在15 ℃以下，接種量為2%，pH值保持原始狀態(tài)的情況下發(fā)酵，對(duì)蛋白質(zhì)還具有一定的降解作用，而且未檢測(cè)到3-甲基吲哚物質(zhì)，只測(cè)定到引起臭味的少量尸胺、腐胺、精胺、亞精胺等物質(zhì)，并且含量較低，感官評(píng)分較好。該菌株經(jīng)過生理生化實(shí)驗(yàn)(吲哚、MR、淀粉還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性；VP、過氧化氫和硫化氫實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽性)以及16S rRNA鑒定后，初步得出該菌種為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，又稱靈桿菌，起名為NXYS-S。