一株可降解馬鈴薯淀粉汁水中蛋白質菌株篩選與發酵產物分析

周慧寧，張一晟，張惠玲，李海峰

(寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川，750021)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是寧夏的戰略性主導產品之一，是寧夏南部山區脫貧致富的支柱產業之一[1]，具有突出的區域優勢和顯著的經濟效益。隨著馬鈴薯產業的不斷發展，馬鈴薯淀粉加工業也在不斷壯大。調查顯示，寧夏南部山區有馬鈴薯加工企業近3 000家，年產量50 t以上的企業近200家，馬鈴薯淀粉廢水排放量近3 106 t[2]。由于直接還田灌溉后會自然發酵導致嚴重污染[3]。國內外主要采用的常規處理方法有物理法、化學法和生物法。綜合國內外研究進展進行分析，采用物理化學法對馬鈴薯淀粉加工汁水進行處理或對汁水中的蛋白進行回收，需要大型設備的支持以及場地的提供，需要消耗大量的試劑耗材，一些中小型工廠無法承受高昂的處理費用，所以物理化學法具有一定的局限性[4]。生物處理法被廣泛應用于現代污水處理,其特點為處理效率高、處理費用低等,但是大部分菌種都需要在適宜的溫度環境下(30～40 ℃)進行發酵，但淀粉生產具有季節性，主要集中在9、10月份，寧夏地區的氣溫較低(15 ℃左右)，不能滿足大部分菌種的生長條件，生物活性降低或喪失。所以，研究新的菌種來處理汁水污染問題已經迫在眉睫。

實驗利用微生物法，篩選1株能夠低溫降解馬鈴薯汁水中蛋白質，但產生臭味很小的菌株，用于發酵馬鈴薯汁水，再將其還田灌溉，避免空氣污染，以達到處理廢水和生產生物活性物質的雙重目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料與儀器

土樣與馬鈴薯汁水，寧夏彭陽縣馬鈴薯汁水灌溉田和固原佳利源馬鈴薯淀粉廠；尸胺、腐胺、精胺、亞精胺(純度≥98.0%)，西格瑪奧德里奇；凝膠成像儀，上海一恒科學儀器有限公司；PCR儀，太倉市實驗設備廠；氣相色譜-質譜聯用儀、高效液相色譜儀，Agilent Technologies；全自動氨基酸分析儀，日立；氮吹儀，合肥艾本森科學儀器有限公司。

1.1.2 培養基的配制[5]

富集培養基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨5，酵母浸粉5，MgSO4·7H2O 0.2，K2HPO41，NaCl 10，Na2CO310，pH 7.2；選擇培養基：選用酪蛋白培養基;種子培養基(g/L)：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母浸粉5，pH 7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的篩選

在250 mL錐形瓶中加入50 mL 0.9%(質量分數)的生理鹽水和幾粒玻璃珠，121 ℃滅菌15 min。稱取5 g土樣放入無菌生理鹽水中搖勻，制成土壤懸浮液。取1 mL土壤懸浮液加入50 mL到富集培養基中，20 ℃培養48 h，得一次增殖培養液[6-7]。重復上述操作，得到二次增值培養液。

液體水樣于20 ℃下恒溫發酵，發酵前期每8 h取樣，后期每12 h取樣，涂布于選擇培養基上[8]。固體土樣將二次增殖培養液用倍比稀釋法制成不同的稀釋度[9]。將兩者20 ℃培養，觀察有無透明圈出現，在菌落邊緣可以看到透明圈的菌株說明能夠降解酪蛋白[5]，即為初篩選菌株。取初篩獲得的菌株分別接種到馬鈴薯淀粉汁水中，20 ℃發酵。測定其發酵前后蛋白質的降解情況，以及感官評價和揮發性物質分析，選擇出氣味較低的菌株即為復篩選菌株。

1.2.2 低溫發酵實驗

對復篩得到的菌種活化擴培，分別接種到馬鈴薯汁水中發酵，溫度為15 ℃，接種量為2%，pH值自然狀態進行發酵。每隔48 h取樣，觀察菌體生長情況，測定其蛋白質降解率，并通過感官評價和揮發性物質的檢測進行驗證，選擇優良菌株。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 菌株形態觀察及生理生化鑒定

參考《常見細菌系統鑒定手冊》[10]及《伯杰細菌鑒定手冊》[11]將目標菌株進行生理生化鑒定。

1.2.3.2 目的菌株16S rDNA序列分析

細菌基因組 DNA 的提取參照試劑盒的說明書進行。利用細菌16S rDNA擴增通用引物 27F和1492R[12]，以目的菌種基因組DNA為模板進行PCR擴增，用Colibri核酸純度測定儀測定DNA-50的濃度，并用1 %(質量分數)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增后的PCR產物純化后由上海生工生物工程有限公司測序，將得到的16S rDNA序列結果提交到NCBI數據庫并進行BLAST比對，找到并下載典型的菌株序列與實驗菌株的序列,用Clustal X 2.0軟件進行同源性分析，并用 MEGA 6.0 軟件構建系統發育樹。

1.3 測定方法

1.3.1 生物胺的檢測

參考ZARGHAMPOUR等[13]的方法，利用高效液相色譜測定腐胺、尸胺、亞精胺、精胺的含量。由圖1得出3種生物胺在10 min內得到了很好的分離，出峰時間依次是腐胺7.999 min，尸胺8.461 min，亞精胺8.877 min，精胺14.459 min通過標準品的時間來確定馬鈴薯淀粉汁水中生物胺的出峰時間。

1-腐胺；2-尸胺；3-亞精胺；4-精胺圖1 生物胺標準物質的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of bioamines

1.3.2 蛋白質的測定

馬鈴薯淀粉汁水中蛋白質含量的測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》采用凱氏定氮法測定[14]。

1.3.3 氨基酸含量的測定

氨基酸組成的測定參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[15]，采用全自動氨基酸分析儀進行測定。

1.3.4 吲哚與3-甲基吲哚的測定

參考孫翠香等[16]的方法，利用氣相色譜法快速測定馬鈴薯加工廢水中吲哚和3-甲基吲哚含量。

1.3.5 揮發性物質測定

參考HE等[17]的方法設定固相微萃取條件。參考趙洪雷等[18]的方法設定氣相色譜條件，根據離子流圖計算各峰面積，按公式(1)計算揮發性物質相對含量：

(1)

式中：m，揮發性物質相對含量，%；A1，峰高，cm；A2，峰寬，cm；s，總面積，cm2。

2 結果與分析

2.1 降解酪蛋白菌株的篩選

2.1.1 初篩結果

選用酪蛋白培養基進行初篩，從土壤和馬鈴薯淀粉汁水中共得到51株可降解酪蛋白的菌株，編號為1、2、44的菌株水解圈直徑D與菌落直徑d的比值[5]大于其余48株菌，見表1。

2.1.2 復篩結果

51株菌分別進行發酵復篩，發酵后汁水的揮發性物質組成及其相對含量如表2、表3所示，雖然發酵后的汁水中均檢出有吲哚、硫化氫、3-甲基吲哚，但其含量的差距較大，1號菌株發酵后的汁水4種胺類物質含量均為最小。1號菌的蛋白質降解率達65.25%，其降解能力高于22號菌跟44號菌，見圖2。綜合比較，1號菌較為優秀，但還需對該3株菌進行低溫發酵實驗，選出在低溫下也能夠具有良好發酵性能的最優菌株。

表1 51株蛋白質降解菌在酪蛋白培養基上的降解能力Table 1 The degradation ability of 51 protein-degrading bacteria on casein culture medium

圖2 不同菌種對蛋白質降解率的影響Fig.2 Effects of different strains on protein degradation rate

2.1.3 低溫發酵實驗

低溫發酵后，1號菌株對蛋白質仍有較強的降解能力，降解率為61.43%，高于2號菌株和44號菌株，見圖3。相比復篩時20 ℃下的降解率有所降低，這是因為溫度降低，菌株的活性降低[19]，對其降解蛋白質的能力有抑制作用。與自然發酵狀態下相比，硫化氫、吲哚、3-甲基吲哚有較大幅度的降低，見表4。各生物胺含量也比較低，尸胺最高為9.14 mg/L，亞精胺最低為2.37 mg/L，所以該菌株可用于馬鈴薯淀粉汁水中蛋白質的降解。

圖3 不同菌株低溫發酵對蛋白質降解率的影響Fig.3 Effect of low temperature fermentation of different strains on protein degradation rate

對發酵后的馬鈴薯淀粉汁水中氨基酸含量進行檢測,結果見表5，其含有豐富氨基酸資源，纈氨酸含量高達21.17 mg/L，苯丙氨酸含量13.14 mg/L，門冬氨酸11.798 mg/L，其中氨基酸分子可以被植物快速吸收，直接利用可以滿足灌溉時作為對營養物質的需求，可使用該汁水進行還田灌溉[20]，且不造成污染。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態學鑒定圖

菌株J001在酪蛋白分離培養基上形態特征如圖4-a 所示，單個菌落中間凸起，不透明，邊緣不規則，大小為1～2.5 mm,呈紅色。顯微鏡下的形態如圖4-b 所示，鏡檢為近球型短桿狀，革蘭氏陰性，無莢膜，無芽孢。

表2 菌株復篩結果Table 2 Re-screening results of strains

表3 不同菌種發酵后揮發性物質的相對含量 單位：%

續表3

表4 低溫發酵后各主要物質含量 單位：mg/L

表5 發酵后馬鈴薯淀粉汁水中各氨基酸含量 單位：mg/L

a-菌落形態；b-鏡檢圖片圖4 菌落形態特征圖Fig.4 The mrophological characteristics of the strain

2.2.2 生理生化鑒定

由表6可知，該菌株為革蘭氏陰性菌，吲哚、MR、淀粉還原實驗結果為陰性；VP、過氧化氫和硫化氫實驗結果為陽性。這些結果顯示1號菌株的生理生化特性與粘質沙雷氏菌的各項生理生化特性都符合。

表6 生理生化鑒定表Table 6 Physiological and biochemical identification

2.2.3 菌株J001的16S rDNA鑒定

1號菌株電泳結果見圖5，經比對，1號菌株與標準菌株NR044385.1在同一支系，相似度達99%，見圖6，故1號菌株初步鑒定為粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)[21],起名為NXYS-S。

圖5 1號菌電泳結果Fig.5 J001pcr amplification electrophoresis

圖6 1號菌株系統發育樹Fig.6 J001 strain phylogenetic tree

3 結論

實驗通過初篩、復篩，以蛋白質降解率和揮發性氣體中的臭味物質為指標，篩選了1株可降解馬鈴薯汁水的菌株，該菌株在15 ℃以下，接種量為2%，pH值保持原始狀態的情況下發酵，對蛋白質還具有一定的降解作用，而且未檢測到3-甲基吲哚物質，只測定到引起臭味的少量尸胺、腐胺、精胺、亞精胺等物質，并且含量較低，感官評分較好。該菌株經過生理生化實驗(吲哚、MR、淀粉還原實驗結果為陰性；VP、過氧化氫和硫化氫實驗結果為陽性)以及16S rRNA鑒定后，初步得出該菌種為粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，又稱靈桿菌，起名為NXYS-S。