Ni/Co層狀氫氧化物模擬氧化物酶可視化檢測海產品中Hg2+

趙海萍，南麗娟，雒雪麗，楊偉霞，韓雍，李忠宏

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌，712100)

Hg2+是海洋中汞污染的主要形式，易被海洋生物轉化為劇毒有機汞[1]。Hg2+會通過被污染的魚、貝、蝦、海帶等海洋生物進入人體，造成有絲分裂受損、DNA損傷、中樞神經系統損害、腦損傷、嚴重的認知障礙、免疫系統功能障礙、腎功能衰竭等[2-3]。即使較低濃度的Hg2+進入人體后也會迅速與細胞內的相關分子產生反應，干擾人體細胞的正常功能，影響正常的生命活動[4]。因此，對海產品中Hg2+的檢測是全世界備受關注的問題。

傳統的Hg2+檢測方法有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質譜法、高效液相色譜法等[5-7]。這些方法雖然具有靈敏度高、選擇性高等優勢，但檢測耗時長、儀器價格昂貴、需專業人士操作、現場檢測困難等缺點妨礙了其應用。為了克服這些困難，相繼開發了各種檢測Hg2+的替代方法，如熒光法、電化學法和比色法等[8-12]。其中，比色法因其檢測過程簡單、快速、成本低、肉眼可觀察等優點被廣泛應用于Hg2+檢測。

近年來，多種納米材料被用作Hg2+檢測的比色傳感器，如碳基納米材料(氧化石墨烯、碳納米管、碳點等)、金屬納米顆粒(Au、Ag、Pt)、金屬氧化物納米顆粒(CuO、Co3O4、MnO2)等[13-21]。但這些材料存在表面積小、分散性差、在低pH條件下不穩定等問題。層狀雙金屬氫氧化物(layered double hydroxides，LDHs)是由2種金屬的氫氧化物層層堆積而成的一種新興的納米材料。因其具有多孔性、高比表面積和均勻分布的活動中心以及前驅體層狀氫氧化物的可調控性，能夠將具有變價特性的過渡金屬定量引入，因此被廣泛應用于催化、吸附、載體等多方面[22-26]。

本文采用共沉淀法制備了Ni/Co層狀氫氧化物(Ni/Co LDHs)。如圖1所示，基于Ni/Co LDHs模擬類氧化物酶活性，可以催化3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB)生成藍色的氧化態TMB(oxTMB)。加入谷胱甘肽(glutathione,GSH)后，由于GSH的硫醇基團阻礙了陽離子自由基的形成，會使得藍色oxTMB的形成變少。當Hg2+被引入Ni/Co LDHs/TMB/GSH體系時，由于汞-硫醇絡合物的形成，釋放了GSH中的TMB，使得藍色恢復。基于這一機理，我們構建了一種海產品中Hg2+的快速比色檢測方法，為納米材料模擬酶在食品分析中的應用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

TMB、氨水、冰乙酸、醋酸鈉、無水乙醇，成都市科隆化學品有限公司；六水氯化鎳，廣東光華科技股份有限公司；六水氯化鈷，天津市科密歐化學試劑有限公司；GSH，阿拉丁(中國上海)；試驗所用試劑均為分析純，試驗用水均為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

UV-2550型紫外可見分光光度計，日本島津；HC-3018R型高速冷凍離心機，北京儀諾科興科技發展有限公司；DZF-6020型真空干燥箱，上海海向儀器設備廠；FE20/EL20型pH計，梅特勒-托利多儀器公司；KH-250E型超聲波清洗器，深圳市得康科技有限公司；Vetex70型傅里葉變換近紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)，德國布魯克公司；CP-224C型分析天平，奧豪斯儀器公司;K-Alpha型X-射線光電子能譜儀(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)，美國熱電公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Ni/Co LDHs的制備

將10 mL 0.1 mol/L CoCl2·6H2O和20 mL 1 mol/L NiCl2·6H2O在磁力攪拌下均勻混合，逐滴加入1 mL 35%(體積分數)的氨水，將上述溶液在50 mL 玻璃瓶中密封3 h。待反應結束后收集樣品，在5 000 r/min離心10 min，分別用去離子水和無水乙醇洗滌3次。所得沉淀物放入60 ℃真空干燥箱中干燥24 h，得到產物Ni/Co LDHs。

1.3.2 Ni/Co LDHs的表征

采用場發射掃描電子顯微鏡觀察Ni/Co LDHs的形貌；由X射線衍射儀獲得Ni/Co LDHs的X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)圖譜，用于表征其晶體結構；利用FTIR進行分析，得到紅外光譜，用于分析Ni/Co LDHs的表面功能基團；用XPS進一步確認Ni/Co LDHs表面的化學信息。

1.3.3 Ni/Co LDHs類氧化物模擬酶催化動力學

1.3.3.1 Ni/Co LDHs類氧化物模擬酶的活性驗證

制備TMB、TMB+Ni/Co LDHs、TMB+Ni/Co LDHs+GSH、TMB+Ni/Co LDHs+GSH+Hg2+4種不同的反應體系，25 ℃孵育10 min后，收集反應體系在652 nm處的吸光度值。用于驗證Ni/Co LDHs的氧化物酶活性。

1.3.3.2 檢測條件的優化

以吸光度值變化大小為指標，檢測不同孵育時間(2、4、6、8、10、12、14、16 min)、體系pH(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)、TMB濃度(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 mmol/L)、孵育溫度(10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃)和Ni/Co LDHs濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol/L)條件下體系吸光度值的變化，優化檢測條件。所有試驗做3個平行。

1.3.3.3 Ni/Co LDHs類氧化物模擬酶催化動力學

通過UV-2550型紫外可見分光光度計以時間掃描模式，測定TMB在652 nm處吸光度隨時間的變化，根據公式(1)Lineweaver-Burk曲線計算Michaelis-Menten常數。

(1)

式中：v為初始速度；vmax為最大反應速度；[S]為底物濃度；Km為米氏常數，表示底物與酶親和力的大小，Km值越小，表明酶與底物之間的親和力越大。

1.3.4 檢測海產品中的Hg2+

1.3.4.1 標準曲線

在最優條件下，將50 μL 1 mmol/L谷胱甘肽、200 μL 0.5 mmol/L TMB、100 μL 0.8 mg/mL Ni/Co LDHs溶液與不同濃度的Hg2+混合，在25 ℃孵育10 min后，檢測反應體系在652 nm處的吸光度值。所得數據用經驗方程式(2)進行擬合，進行數據分析，并繪制標準曲線，得到相關系數R2。由公式(3)得到檢測線性范圍及檢測限。

(2)

(3)

1.3.4.2 干擾試驗

為了研究其他離子對檢測體系的干擾性，擬以水中常見的金屬離子，如Na+、Mg2+、Cu2+、Cr3+、Pb2+、Mn2+、Zn2+等來評價該方法的選擇性。將2 mL pH 4.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液、200 μL 0.5 mmol/L的TMB、50 μL 0.8 mg/mL的Ni/Co LDHs、50 μL 1 mmol/L的GSH以及 0.1 mmol/L的不同金屬離子依次加入，均勻混合。在25 ℃孵育10 min后，檢測反應體系在652 nm處的吸光度值。所有試驗做3個平行。

1.3.4.3 實際樣品檢測

為了評估Ni/Co LDHs對海產品中Hg2+檢測的適用性，選用大黃魚(Larimichthyscrocea)和海帶(Saccharinajaponica)(購于當地超市)進行實際樣品檢測。先對海產品樣品進行消解預處理[27]，分別將0.5 g的魚和海帶樣品放入錐形瓶中，依次滴入15 mL HNO3和2.5 mL H2SO4。混合物在室溫下放置12 h，然后煮沸直到溶液變清。冷卻至室溫后(20 ℃ 左右)，用1 mol/L NaOH溶液調pH值至4.0。用蒸餾水將所得溶液稀釋至100 mL。用構建的傳感器檢測處理后的樣品溶液。所有試驗做3個平行。

2 結果與分析

2.1 Ni/Co LDHs的表征

通過掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察到制備的Ni/Co LDHs的形貌如圖2-a和2-b所示。可以看出Ni/Co LDHs呈均勻的三維花狀微球結構，這種花狀結構會使結構更穩定，比表面積更大，活性位點更暴露，有利于Ni/Co LDHs與目標物的接觸，從而提高催化性能[28]。為進一步驗證在Ni/Co LDHs中各種元素的分布是否均勻，在一塊三維花狀區域上分別選取O、Ni、Co 3種元素進行mapping測試，結果如圖2-c所示，O、Ni、Co元素在Ni/Co LDHs中分布均勻。通過XRD和紅外光譜對制備的Ni/Co LDHs納米微球的組成進行了分析。XRD圖譜如圖3-a所示，在11.4、22.6、34.3、38.7處的4個特征峰歸屬于(003)、(006)、(012)、(015)晶面，這與Ni/Co LDHs以前的報道一致[28]。FTIR圖譜如圖3-b所示，在3 354 cm-1處的峰屬于—OH的伸縮振動，較寬的羥基吸收峰表明Ni/Co LDHs表面上具有多個羥基結構，賦予其更高的極性和親水性，可以穩定的分散在水中[29]。1 391 cm-1處的譜帶歸因于層間CO2的振動，可能是由于大氣中溶解的CO2分子吸收。523、564、637、860 cm-1處的峰歸因于M—O、O—M—O和M—O—M(M代表Ni或Co)的晶格振動模式。2 928、2 820、1 620、1 457和1 053 cm-1處的峰歸因于乙醇分子的C—O、C—H和C—C基團。通過XPS分析了Ni/Co LDHs中元素的價態，結果如圖3-c所示，有284.73、530.72、781.70和856.98 eV 4個典型的峰，分別是C 1s、O 1s、Ni 2p和Co 2p的XPS特征峰，這說明合成的Ni/Co LDHs的表面主要由C、O、Ni和Co 4種元素組成。接著對Ni 2p、Co 2p和O 1s的掃描圖譜分峰擬合，由圖3-d所示的Ni 2p的高分辨圖可知，除了861.83和879.94 eV處的sat外，Ni 2p譜有4個峰，其中855.75和873.25 eV表明Ni2+的存在，856.55和874.53 eV表明Ni3+的存在。由圖3-e所示的Co 2p的高分辨圖可知，除了785.98和803.10 eV處的sat外，Co 2p譜有4個峰在781.38、796.81和783.21、798.04 eV處，分別對應于Co3+和Co2+，Co3+的形成可能是溶解氧在合成過程中Co2+被氧化。O 1s的高分辨圖如圖3-f所示，有531.60、531.15和530.65 eV 3個典型的衍射峰，531.60 eV是由吸收的水分產生的，531.15 eV是由—OH產生的，530.65 eV是由金屬氧鍵(Ni—O和Co—O)產生的。結果表明，在XPS光譜中，Ni/Co LDHs表面存在著Ni和Co的混合價態。Ni3+和Co3+陽離子通常被認為是催化活性中心，因此Ni/Co LDHs表面大量的Ni2+/Ni3+和Co2+/Co3+的氧化還原電對有利于反應過程中氧的轉移[29]。

圖1 比色法檢測Hg2+Fig.1 Detection of Hg2+ by colorimetric assay

a-Ni/Co LDHs的SEM圖；b-Ni/Co LDHs的SEM放大圖； c-Ni/Co LDHs的元素面掃描圖圖2 Ni/Co LDHs的SEM圖Fig.2 The SEM images of Ni/Co LDHs

2.2 Ni/Co LDHs類氧化物模擬酶的活性驗證

以4種不同的反應體系探究了Ni/Co LDHs的類氧化物活性，結果如圖4所示。在加入Ni/Co LDHs之前，TMB為無色透明溶液，加入Ni/Co LDHs之后，TMB溶液逐漸變為藍色，在652 nm處出現較強的吸收峰，這是因為無色的TMB被氧化為藍色的oxTMB；在此體系中繼續加入GSH，反應體系逐漸變淺，這是因為引入的Ni/Co LDHs能夠催化氧化TMB生成TMB陽離子自由基[9]；當在TMB/Ni/Co LDHs的傳感體系中加入抗自由基生物分子GSH時，溶液顏色由藍色逐漸變淺至無色，這是因為GSH的硫醇基團阻礙了陽離子自由基的形成，使TMB分子得到恢復。隨后在該傳感系統中加入Hg2+，Hg2+能夠與GSH的硫醇基團結合，從而使得Hg2+與TMB競爭結合GSH，且Hg2+與GSH的親和力強于TMB與GSH的親和力，最終使得與GSH的硫醇基團結合的TMB釋放，促進了傳感系統的催化氧化反應，溶液呈現為藍色。因此，Ni/Co LDHs納米球可以作為類氧化物模擬酶檢測Hg2+。

a-Ni/Co LDHs的XRD全掃描圖；b-Ni/Co LDHs的FTIR全掃描圖；c-Ni/Co LDHs的XPS全掃描圖；d-Ni 2p；e-Co 2p； f-O 1s的高分辨掃描圖圖3 Ni/Co LDHs的XRD、FTIR、XPS圖譜Fig.3 XRD, FTIR, XPS spectra of Ni/Co LDHs

圖4 Ni/Co LDHs 模擬酶活性驗證Fig.4 Activity verification of Ni/Co LDHs mimetic enzyme

2.3 檢測條件的優化

為了獲得最佳的Hg2+檢測性能，探究了氧化的TMB吸光值變化與體系pH、TMB濃度、孵育溫度、孵育時間、LDHs濃度的變化關系。

2.3.1 體系pH

類似于天然酶，例如辣根過氧化物酶，Ni/Co LDHs的催化活性也顯示出對pH和溫度的依賴性。在其他條件不變的情況下，分別加入不同pH值的緩沖液進行優化，結果如圖5-a所示。隨著pH值由2.0逐漸增大到4.0，吸光度值逐漸增大，隨著pH值由4.0逐漸增大到6.0，吸光度值逐漸減小。在pH<4.0 時，TMB的氧化產物會傾向于生成黃色的二亞胺終止反應，pH>4.0時，酶活性有所減弱。因此，選擇pH 4.0用于Hg2+檢測。

2.3.2 TMB濃度

在其他條件不變的情況下，通過改變TMB濃度，探討TMB濃度對Ni/Co LDHs活性的影響，結果如圖5-b所示。試驗結果表明，隨著TMB濃度的增大，吸光度值不斷增大。吸光度值在0～0.5 mmol/L隨著TMB濃度的增大急劇增大；在0.5～2 mmol/L隨著TMB濃度的增加，吸光度值逐漸增大；在2～10 mmol/L隨著TMB濃度的增加，吸光度值緩慢增大。這是因為隨著TMB濃度的升高，使得底物TMB和Ni/Co LDHs模擬酶的活性位點接觸機會增多，有效碰撞增加，從而提高了活性。綜合考慮傳感器檢測的靈敏度、試驗安全性，選擇0.5 mmol/L的TMB用于檢測水中Hg2+。

2.3.3 孵育溫度

溫度是影響模擬酶活性的重要因素之一。在10～55 ℃研究了Ni/Co LDHs的催化活性對溫度的依賴性，結果如圖5-c所示。當溫度在10～25 ℃時，吸光度值逐漸增大，25～50 ℃，吸光度值明顯減小，當溫度在50～60 ℃時，吸光度值緩慢減小。隨著溫度的升高，體系中反應物分子運動更加劇烈，使得底物TMB和Ni/Co LDHs模擬酶的活性位點接觸機會增多，有效碰撞增加，更容易發生催化反應，所以其活性也逐漸增強。結果表明，在25 ℃時反應體系的吸光度值最大，試驗效果最佳。當反應溫度低于25 ℃或高于25 ℃時，吸光度值較低，溶液所呈現出來的顏色較淺，不利于后續可視化檢測。因此，選擇檢測溫度為25 ℃用于Hg2+檢測。

2.3.4 Ni/Co LDHs濃度

研究Ni/Co LDHs濃度以評估Ni/Co LDHs的催化活性，結果如圖5-d所示，Ni/Co LDHs質量濃度在0～0.8 mg/mL時，隨著濃度的增加吸光度值呈平穩上升趨勢,質量濃度在0.8～1.0 mg/mL時，吸光度值緩慢平穩下降。由此可知，Ni/Co LDHs的質量濃度為0.8 mg/mL時反應體系檢測效果最好。因此，選擇Ni/Co LDHs質量濃度為0.8 mg/mL用于Hg2+檢測。

2.3.5 卵育事件

研究孵育時間以評估Ni/Co LDHs的催化活性，結果如圖5-e所示。隨著反應時間的不斷增加，吸光度值呈上升的趨勢。在1～10 min時，吸光度值急劇上升，在10～16 min時，吸光度值隨著時間的增加緩慢上升。實驗結果表明，在10 min時，反應速率變慢，檢測體系反應效果基本達到最優，過長的反應時間不利于其快速即時檢測，因此選擇10 min為其最優的反應時間，其檢測響應效果良好。

綜上所述，選擇pH 4.0，0.5 mmol/L TMB，孵育溫度為25 ℃，Ni/Co LDHs質量濃度為0.8 mg/mL，孵育時間10 min用于后續試驗。

a-pH體系；b-TMB濃度；c-孵育溫度；d-Ni/Co LDHs質量濃度；e-孵育時間圖5 檢測條件優化Fig.5 Optimization of detection conditions

2.4 Ni/Co LDHs類氧化物模擬酶的催化動力學

在最優條件下，通過改變TMB的濃度，測定反應溶液在652 nm處的吸光度值，計算得到相應的動力學數據。通過穩態動力學研究，發現Ni/Co LDHs納米材料作為類氧化物模擬酶，其催化反應與天然酶的反應動力學相似。結果如圖6-a所示，反應速率隨著底物濃度的增加而加快，最終達到穩定狀態，符合典型的米氏曲線。再通過雙倒數作圖法，得到如圖6-b 所示的倒數圖。從圖6-b可以得到反應的米氏常數Km=0.945 7 mmol/L，最大反應速率vmax=2.63×10-9mol/(L·s)。Km被認為是酶對底物親和力的指示物。Km越小，底物與酶的親和力越強。通過與其他納米酶比較，Ni/Co LDHs對TMB的Km值稍大于其他納米酶的Km，表明Ni/Co LDHs對TMB的親和力低于其他納米酶。

a-TMB 濃度與速率關系曲線；b-Lineweaver-Burk線性擬合圖6 Ni/Co LDHs 穩態動力學Fig.6 Steady-state kinetic analysis of Ni/Co LDHs

2.5 標準曲線

為了構建一個比色檢測水中Hg2+的傳感器，依次將TMB(0.5 mmol/L)、GSH(1 mmol/L)、Ni/Co LDHs(0.8 mg/mL)和不同濃度的Hg2+加入到緩沖液(pH 4.0)中，并在25 ℃下孵育10 min后掃描紫外光譜，所得的紫外光譜如圖7所示，隨著Hg2+濃度的增大，在652 nm處的吸光度值逐漸增大，體系溶液對應的顏色變化如圖7-a中圖例所示。由經驗方程擬合后，Hg2+在2.96～11.63 μmol/L具有良好的線性關系，標準曲線回歸方程為y=0.020 8x-0.011 9，其中x為Hg2+濃度，相關系數R2=0.992 2，根據公式(3)計算檢測限為30.60 nmol/L。

a-在加入不同濃度的Hg2+ 時，Ni/Co LDH+TMB+GSH 傳感探針的紫外光譜(圖例：顏色隨Hg2+ 濃度的變化)； b-光度值隨Hg2+ 濃度變化圖圖7 檢測Hg2+ 的標準曲線Fig.7 The standard curve for Hg2+ detection

2.6 干擾試驗

本論文所開發的比色傳感器的選擇性對于實際水樣中Hg2+含量的測定至關重要。在最佳條件下，通過對于實際水樣中可能存在的其他金屬離子，如Na+、Mg2+、Cu2+、Cr3+、Pb2+、Mn2+、Pb2+和Zn2+進行干擾性試驗來評價該方法的選擇性，結果如圖8所示，Hg2+測定具有較好的選擇性，Na+、Mg2+、Cu2+、Cr3+、Pb2+、Mn2+、Pb2+、Zn2+對檢測的影響十分微弱(P>0.05)。因此，本比色檢測方法對于水中Hg2+檢測具有較好的選擇性。

圖8 Ni/Co LDH對4.16 μmol/L Hg2+ 和 相同濃度干擾離子的吸光度值Fig.8 Absorbance value of Ni/Co LDHs to 4.16 μmol/L Hg2+ and interfering ions with the same concentration

2.7 實際樣品檢測

為了研究該方法在實際海產品樣本中檢測Hg2+的可行性與可靠性，實驗采用空白加標回收評價方法的準確度。海產品樣品中未檢測到Hg2+，在消解處理后的海產品樣品中加入不同濃度的Hg2+進行檢測分析，試驗結果如表1所示，加入已知不同Hg2+的空白加標回收率都在92.74%～114.40%，相對標準偏差為0.56%～4.37%。結果表明該方法檢測海產品中的Hg2+具有較高的可靠性和可行性，有較好的準確度和精密度。

表1 檢測海產品樣品中不同濃度Hg2+ 的回收率Table 1 Recoveries of the detection of different concentration Hg2+ in seafood samples

3 結論

通過共沉淀法合成的Ni/Co LDHs納米材料模擬氧化物酶，具有較高的催化活性和較好的穩定性。以檢測體系pH、TMB濃度、孵育時間、孵育溫度和Ni/Co LDHs濃度為單因素，優化得到檢測Hg2+的最佳條件為pH 4.0、TMB濃度為0.5 mmol/L、溫度為25 ℃、孵育時間為10 min、催化劑質量濃度為0.8 mg/mL；在最優檢測條件下該傳感器在2.96～11.63 μmol/L具有良好的線性響應，檢測限為30.60 nmol/L。該方法的加標回收率為92.74%～114.40%，干擾試驗表明可能存在的干擾物質對傳感器沒有顯著影響，因此該傳感器用于檢測海產品中Hg2+具有可接受的選擇性，可為海產品中Hg2+的比色檢測提供一種新思路。