基于GC-MS結合化學計量學的濃香型白酒分類方法

胡雪，李錦松，唐永清，張良，錢宇, , 3*，趙金松,4*

1(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢，643000)2(瀘州老窖集團有限責任公司，四川 瀘州，646000) 3(四川大學 化學學院，四川 成都，610064)4(川酒集團，四川 成都，610000)

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，是以糧物為原料，大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發酵劑，經蒸煮、糖化、發酵、蒸餾而制成的，具有悠久的歷史，在國內外都享有盛譽[1]。白酒中的風味成分含量極低，僅占總質量的1%～2%[2]。目前，白酒中已知的風味化合物超過1 000種[3]。由于釀造工藝、生產原料、窖藏條件等的不同造就了這些微量和痕量風味物質的種類和含量的差異，決定了白酒的風格、香型、品質。

近年來，GC、GC-MS、電感耦合等離子體質譜(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)、HPLC、近紅外(near infrared spectrometry，NIR)等儀器在酒類飲料研究中廣泛應用[4-7]。鑒于GC-MS方法超高的分離能力和對未知化合物準確的鑒定能力已被大量應用于酒類飲料的摻假識別[8]、身份鑒別[9]、年份酒鑒定等研究并取得了一定成果[10-12]。但利用GC-MS方法結合化學計量學的方法對濃香型白酒分類的研究還相對較少。

隨著各種檢測技術的不斷成熟，白酒的檢測方法已不再阻礙對其風味物質的定性定量研究，找到一種有效的數據處理和分析方法才是目前面臨的問題。聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)、主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)、人工神經網絡(artificial neural networks，ANN)和支持向量機(support vector machine，SVM)等化學計量學方法通常是結合各種檢測技術用于食品藥品等的分析研究[13-16]。ZHENG等[17]利用GC-MS結合PCA和PLS-DA對不同品牌的濃香型原酒進行了有效區分。WU等[18]利用紫外可見光譜結合PCA和SVM以及PLS-DA對不同產地的米酒進行區分，其正確率高達100%。WU等[19]利用多種同位素和金屬元素結合多種化學計量學的分析方法能對進口紅酒的產地進行有效的驗證分析。綜上所述，利用化學計量學結合各種檢測技術能對數據隱含的更深層次的信息進行有效挖掘和分析。

本實驗以6個不同品牌的31種濃香型白酒為研究對象，以GC-MS為檢測手段，利用33種共有風味物質結合HCA、PCA和PLS-DA等化學計量學的方法，分析了濃香型白酒中風味物質間的差異，可為濃香型白酒快速分類以及多樣品間風味成分比對分析提供理論依據和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試驗材料為6個不同品牌的濃香型白酒，所有酒樣均購于京東官方自營旗艦店，樣品具體信息見表1。

表1 濃香型白酒酒樣信息Table 1 The detail of the strong-flavor Baijiu samples

風味物質標準品(色譜級及以上)：正丙醇、仲丁醇、正丁醇、2-甲基丙醇、乙酸乙酯、乙酸、異戊醛、2-戊酮、丙酸乙酯、異戊醇、正戊醇、丁酸乙酯、正己醇、戊酸乙酯、己酸、己酸乙酯、己醛二乙縮醛、庚酸乙酯、己酸丁酯、丙酸、丁酸、庚酸、辛酸、叔戊醇，天津光復化學試劑有限公司；乙縮醛、乳酸乙酯、乙酸正戊酯、無水乙醇，北京壇墨質檢標準物質中心；2-甲基丁酸乙酯、丁醛二乙縮醛、乙酸己酯、己酸己酯、十六酸乙酯，百靈威科技有限公司；己酸丙酯、亞油酸乙酯，阿拉丁試劑(上海)有限公司；C7-C40正構烷烴，北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

TSQ8000三重四極桿氣相色譜質譜、AI1310多功能自動進樣器，美國Thermo Fisher Scientific公司；HP-5毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 定性分析

結合風味物質的保留時間指數(retention index，RI)和NIST 12質譜庫進行定性分析。

1.3.2 定量分析

白酒中風味成分的定量分析方法參考國家標準GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。將待測風味成分的標準物質精確量取并用60%(體積分數)乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中，所有待測風味成分的體積分數均為0.02%。在樣品分析前，首先對混合標準溶液進行分析，利用峰面積及標準物質的含量計算出每種風味化合物的校正因子。分別以乙酸正戊酯，2-乙基丁酸，叔戊醇作為酯類、酸類及醇類和其他類別風味成分的內標物。

1.3.3 GC-MS檢測方法

GC條件：初始溫度為40 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升高至120 ℃，保持1 min，以40 ℃/min速率升高至290 ℃；載氣為He, 柱流量 1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃, 進樣量：1 μL，分流比 50∶1。

MS條件：電離方式EI，電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；傳輸線為260 ℃；掃描方式為全掃描；掃描質量范圍(m/z)30～550。

1.4 數據統計與分析

利用ChemPattern軟件(科邁恩北京科技有限公司)和SPSS 24.0對數據進行化學計量學分析，Excel 2016、Origin 2018軟件對測定數據進行整理統計和畫圖分析。

2 結果與分析

2.1 精密度和回收率分析

分析酒樣前，進空白樣品(甲醇)做對照。取配制好的混合標準溶液連續6次平行測試，統計任意一個風味成分的保留時間和峰面積，結果顯示峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)<2%，峰保留時間的 RSD 值均< 0.1%。在樣品風味成分定量結果的基礎上進行加標回收實驗，加標回收率為90.83%～104.35%，表明實驗儀器穩定且根據本實驗方法測得的結果可信。

2.2 風味物質的定性與定量

利用GC-MS，采取直接進樣的方式，在15 min內共檢測到112種化合物。在扣除乙醇峰后，利用面積歸一化法，以峰高>0.5%為界，共篩選出33種含量較高的風味成分作為研究對象進行定量分析，結果見表2。其中酯類14種，醇類8種，酸類6種和5種醛酮類物質。酯類是濃香型白酒中的主要呈香物質，具有令人愉悅的水果香氣[20]，以己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯為主，但在不同品牌的酒樣中4類酯的含量差異較大，JSY和YJGJ中己酸乙酯的含量相較于其他品牌略低，YJGJ酒樣中乙酸乙酯含量相較于其他品牌稍低，所有樣品的乳酸乙酯和丁酸乙酯的含量相差不大。醇類為發酵過程中氨基酸脫氨或糖脫羧產生[21]，在6個品牌中WLY、YH、JSY樣品中的醇類物質含量相較于SXTB、LZLJ更高。酸類則為糖類發酵的產物[20]，濃度較低時具有一定的奶酪香氣，能夠增加白酒香氣的復雜性，而濃度較高具有明顯的酸敗味。由表2可知，不同品牌樣品的酸類物質在含量上相差不大，以乙酸和己酸為主。以乙縮醛為代表的羥基類化合物大量存在于樣品中，主要是對風味及口感有影響[20]，研究對象中WLY和YH酒樣的羥基類化合物略高于其他品牌白酒。然而，從測試結果統計來看，單一或者多種風味成分的含量及量比關系并不能實現對白酒品牌的區分和鑒別，因此，需要借助其他數據分析手段對定量結果進行挖掘以獲得更多的可用信息來得到更好的分類效果，如PCA，HCA，ANN，PLS-DA等化學計量學手段。

表2 不同品牌酒樣中風味物質含量Table 2 The content of flavoring compounds in different brands of liquor samples

2.3 聚類分析

HCA是將研究對象按照相似度進行自然聚集的一種技術，為一種無監督模式識別方法，是將研究對象分為相對同質群組的統計分析技術[22]。在本實驗中，以33種風味物質含量為變量，對數據進行標準化處理，其聚類分析結果顯示(圖1)，6個品牌的31個濃香型白酒被聚成2大類和6個小類，相同品牌不同類別的酒樣能按照品牌單獨聚集為一類，不同品牌間樣品具有明顯差異，說明聚類分析對濃香型白酒區分具有一定的指導意義。

2.4 主成分分析

PCA是一種在無監督模式下對多個變量通過線性變換以選出較少個數重要變量的一種多元統計分析方法[23]。在對實驗樣品進行PCA之前，使用相關系數矩陣對數據進行適應性檢驗，結果顯示33種風味物質呈顯著正相關(P<0.05)，表明酒樣中的風味物質間的相關性較強，能用PCA方法對其進行處理。利用PCA對樣品的33種共有風味成分進行分析，其中前3個主成分累計方差貢獻值為72.95%，基本保留了原來變量的信息。由PC1、PC2、PC3的得分構建的三維和二維散點圖(圖2)可知，6個不同品牌的濃香型白酒能被較好分類，每個品牌間樣品的聚集程度與HCA得到的結果一致，表明在對白酒品牌的鑒別時，PCA和HCA可以相互驗證。

圖1 不同品牌濃香型白酒的聚類分析Fig.1 Hierarchical cluster analysis in different brands of strong-flavor Baijiu samples

a-PC1，PC2，PC3三維散點圖；b-PC1，PC2散點圖；c-PC1，PC3散點圖圖2 不同品牌濃香型白酒PCAFig.2 The PCA in different brands of strong-flavor Baijiu samples

2.5 偏最小二乘判別分析

在HCA和PCA的分析結果上，進一步利用PLS-DA對樣品數據進行處理。PLS-DA是一種基于偏最小二乘回歸算法的線性分類方法，該模型適用于多自變量并且強線性情況的分析和預測，能從數據內部的角度來解釋所提取的主因子[24]。對6個品牌的濃香型白酒進行PLS-DA，提取的3個成分變量信息占總原始變量信息的74.19%，表明這3個成分可反映白酒中風味物質的總體情況。利用前3個成分的得分做三維散點(圖3)，可得，PLS-DA的分類結果與HCA，PCA結果相似，都對研究樣品進行有效鑒別和分類。隨機從6個品牌中任意挑選1個樣品作為 “測試集”，其余的25個酒樣作為“訓練集”，對測試集樣本做判別，用判定結果與實際情況對比。判別結果如圖4所示，測試集樣本的預測結果準確率為100%，能有效地對不同品牌的酒樣進行分類和鑒定。

圖3 不同品牌濃香型白酒PLS-DAFig.3 The PLS-DA in different brands of strong-flavor Baijiu samples

圖4 PLS-DA預測分類結果Fig.4 PLS-DA predictive classification result

2.6 不同品牌濃香型白酒風味差異原因分析

本次試驗利用33種共有風味物質，多種化學計量學方法能將6個不同品牌的酒樣有效分類。同時，在HCA、PCA和PLS-DA分析中，6個品牌按照接近程度可以概括為2大類：WLY和YH為一類，剩余樣品為一類。WLY與YH的酒樣更相近，而與同一產區的LZLG相距較遠，造成這種現象的原因可能有以下幾個方面：(1)生產原材料[25]。LZLG白酒釀造原料主要以單糧(高粱)為主，而WLY和YH等多采用多糧，原料包括高粱，大米，小麥，玉米，糯米等，但彼此之間的混合比例在不同酒廠也有差異，導致最終的風味和口感也稍有差異。(2)釀造工藝[26]。以LZLJ為例，LZLJ采用原窖法釀造，窖香濃郁，風味統一；WLY采用跑窖法，曲香、糧香突出，窖香偏弱；洋河采用“混蒸混燒、蒸五下四”的老五甑發酵工藝，酒質偏甜，綿性好。(3)窖池及其微生物群落等[27]。發酵用的窖池及其微生物群落的差異也會造成白酒風味存在一定差異，而微生物群落的分布與地質、水源、氣候、環境、溫度等密切相關。因此，造成不同品牌白酒風味差異的因素有很多，但每個品牌獨特的原料配方及釀造工藝造就了每個白酒的特有風味和口感，因而，本文從白酒風味成分入手，利用多種化學計量學手段，能將不同品牌白酒進行有效區分和鑒別。

3 結論

采用GC-MS直接進樣的分析方法對市售暢銷的不同品牌濃香型白酒的風味物質進行了定性和定量研究，具有簡單，快速，經濟且對樣品無損的優點。利用33種共有風味物質對所有樣品進行HCA、PCA和PLS-DA。HCA，PCA能將6個不同品牌的酒樣進行有效分離。PLS-DA也能將6個品牌的酒樣區分開，且在判定結果中測試樣本與訓練樣本的正確率均為100%。因此，利用GC-MS的檢測技術結合多種化學計量學分析方法能對不同品牌的濃香型白酒進行有效的分類和鑒定。