高效液相色譜法測(cè)定十字花科蔬菜中蘿卜硫素的含量

孔凡華，楊春雪，方從容，邱楠楠，徐佳佳，白沙沙，李東，崔亞娟*

1(北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所，北京，100069)2(國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100021)

蘿卜硫素(sulforaphane, SFN)又稱(chēng)“萊菔硫烷”，廣泛存在于十字花科植物類(lèi)[1]，是目前防癌抗癌效果最好的植物天然產(chǎn)物之一，是自然界存在的誘導(dǎo)II型解毒酶能力最強(qiáng)的誘導(dǎo)物，可以抑制并殺死癌細(xì)胞[2]，可顯著降低肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌等癌癥的發(fā)生[3-7]。SFN具有抗菌、提高機(jī)體抗氧化能力和免疫力等藥理作用，在預(yù)防和治療糖尿病、心腦血管疾病等方面也具有重要的藥用價(jià)值[8-9]。國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有建立十字花科蔬菜中蘿卜硫素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，文獻(xiàn)中的提取方法仍存在一些爭(zhēng)議，如SIVAKUMAR等[10]認(rèn)為在0.1 mol/L鹽酸條件下提取效果較好，隨后RENATO等[11]致信編輯部，質(zhì)疑pH 1.0 是否可以提高葡萄糖苷釋放萊蘿卜硫素的效率。NATHAN等[12]認(rèn)為水解8 h可以充分獲得蘿卜硫素，這樣提取耗時(shí)較長(zhǎng)，ZHANG等[13]認(rèn)為超聲處理可提高提取效率，減少水解時(shí)間，因此，如何準(zhǔn)確定量十字花科蔬菜中蘿卜硫素的含量還有待研究。蘿卜硫素的檢測(cè)方法有熒光誘導(dǎo)毛細(xì)管電泳法、生物傳感法、化學(xué)測(cè)定法和色譜方法，色譜方法包括氣相色譜法、高效液相色譜法和質(zhì)譜聯(lián)用法[14-18]。化學(xué)法步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，分析結(jié)果靈敏度較低，由于蘿卜硫素性質(zhì)不穩(wěn)定，氣相色譜法高溫會(huì)破壞蘿卜硫素的結(jié)構(gòu)，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)十字花科蔬菜中蘿卜硫素的提取試劑、提取方式、水解條件進(jìn)行優(yōu)化處理，以蘿卜硫素含量的高低作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳前處理?xiàng)l件。以西蘭花、圓紅蘿卜為研究對(duì)象，進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，考察方法的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和適用性，以期建立十字花科蔬菜中蘿卜硫素的準(zhǔn)確分析檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西蘭花、圓紅蘿卜、芥蘭、花椰菜、圓白菜、紫甘藍(lán)、大白菜、小白菜、菜心、胡蘿卜、薺菜,超市購(gòu)買(mǎi)；蘿卜硫素(純度95%，Cas：4478-93-7)，大連美侖生物技術(shù)有限公司；甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈(均為色譜純)，美國(guó)Fisher公司；丙酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸(分析純)，北京化工廠。

BS224S分析天平，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；METTLER TOLEDO pH計(jì)，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；IKA VORTEX 3渦旋振蕩器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；ZHWY-110X30往復(fù)式恒溫水浴搖床，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超市儀器有限公司；HITACHI CF16RXII 高速冷凍離心機(jī)，日本日立科技有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測(cè)器和ChemStation for LC systems色譜工作站)，美國(guó)Agilent公司；C18色譜柱[5 μm，150 mm×4.6 mm(內(nèi)徑)]，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，置于10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，得到濃度為2.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 提取條件的選擇

1.2.2.1 提取溶劑的選擇

稱(chēng)取2.0 g(精確至0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL離心管中，參考趙登奇等[19]的方法，分別加入10.0 mL pH=6.0的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后于45 ℃水浴2.5 h，冷卻至室溫后，分別加入20 mL二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈超聲提取(功率為100 W，25 ℃)10 min，4 ℃條件下5 000 r/min離心5 min，有機(jī)層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉濾入150 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，重復(fù)提取2次，45 ℃條件下旋轉(zhuǎn)至干，5 mL乙腈定容，過(guò)0.45 μm濾膜后供液相色譜測(cè)定。

1.2.2.2 提取方式的選擇

稱(chēng)取2.0 g(精確至0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL離心管中，分別加入10.0 mL pH=6.0的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后于45 ℃水浴2.5 h，冷卻至室溫后，分別加入 20 mL乙酸乙酯超聲提取(功率為100 W，25 ℃)、振蕩提取(180 r/min)和渦旋提取10 min，其他操作步驟同1.2.2.1。

1.2.2.3 提取時(shí)間的選擇

稱(chēng)取2.0 g(精確至0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL 離心管中，分別加入10.0 mL pH=6.0的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后于45 ℃水浴2.5 h，冷卻至室溫后，分別加入 20 mL乙酸乙酯渦旋提取30 s、1、3、5、10 min，其他操作步驟同1.2.2.1。

1.2.3 水解條件的選擇

1.2.3.1 水解溶液的選擇

稱(chēng)取2.0 g(精確至0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL離心管中，分別加入10.0 mL pH=1.0鹽酸水溶液、pH=2.0鹽酸水溶液、pH=3.0鹽酸水溶液、pH=4.0鹽酸水溶液、pH=5.0鹽酸水溶液、pH=5.0磷酸緩沖液、pH=6.0磷酸緩沖液和去離子水，混合均勻后于45 ℃水浴2.5 h，冷卻至室溫后，分別加入20 mL乙酸乙酯渦旋提取1 min，其他操作步驟同1.2.2.1。

1.2.3.2 水解時(shí)間的選擇

稱(chēng)取2.0 g(精確至 0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL離心管中，分別加入10.0 mL pH=3.0鹽酸水溶液，混合均勻后于45 ℃水浴0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0 h，冷卻至室溫后，分別加入20 mL乙酸乙酯渦旋提取1 min，其余步驟同1.2.2.1。

1.2.3.3 水解溫度的選擇

稱(chēng)取2.0 g(精確至0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL離心管中，分別加入10.0 mL pH=3.0鹽酸水溶液，混合均勻后于25、35、45、55 ℃水浴0.5 h，冷卻至室溫后，分別加入20 mL乙酸乙酯渦旋提取1 min，其余步驟同1.2.2.1。

1.2.4 色譜測(cè)定條件

色譜柱：C18色譜柱[5 μm，150 mm×4.6 mm(內(nèi)徑)]；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-水(20∶80，體積比)；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)201 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.5 方法驗(yàn)證

按照GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[20]方法學(xué)要求，建立校準(zhǔn)曲線及校準(zhǔn)曲線的工作范圍；逐步稀釋樣品上機(jī)測(cè)定，R(S/N)=3時(shí)的測(cè)定濃度作為檢出限，R(S/N)=10時(shí)的測(cè)定濃度作為定量限；分別稱(chēng)取西蘭花和圓紅蘿卜，按照實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的方法，平行測(cè)定6次，計(jì)算蘿卜硫素的含量，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的重現(xiàn)性；向樣品本底添加低、中、高3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行3水平3平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以回收率的高低評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度。

1.2.6 檢測(cè)方法的應(yīng)用

選擇具有代表性樣品，包括芥蘭、花椰菜、圓白菜、紫甘藍(lán)、大白菜、小白菜、菜心、胡蘿卜、薺菜等，按照實(shí)驗(yàn)建立方法，對(duì)蘿卜硫素定量測(cè)定，所有樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2.7 蘿卜硫素含量的計(jì)算

1.2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成2.00、4.00、8.00、20.00、40.00、100.00 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，搖勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入高效液相色譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.7.2 結(jié)果計(jì)算

試樣中蘿卜硫素的含量按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：X,試樣中蘿卜硫素的含量，mg/100g；C,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣中蘿卜硫素的質(zhì)量濃度，μg/mL；m,試樣的稱(chēng)樣量，g；V,定容液的體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)與儀器配套的 ChemStation for LC systems工作站軟件完成數(shù)據(jù)的采集與處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 提取溶劑的選擇

本試驗(yàn)根據(jù)前人研究成果選取5種不同提取溶劑，比較不同提取溶劑對(duì)西蘭花中蘿卜硫素的提取效果，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，乙酸乙酯對(duì)西蘭花中蘿卜硫素的提取效果最佳，實(shí)驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為蘿卜硫素的提取試劑。

表1 不同提取溶劑的提取結(jié)果(n=3)Table 1 Results of different extraction solvents(n=3)

2.1.2 提取方式的選擇

超聲提取、振蕩提取和渦旋提取對(duì)西蘭花中蘿卜硫素的提取效果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，渦旋提取對(duì)西蘭花中蘿卜硫素的提取效果最佳，這可能是因?yàn)闇u旋的高速旋轉(zhuǎn)可以更好地促進(jìn)樣品和提取溶劑的混合，使蘿卜硫素的提取效率更高，故實(shí)驗(yàn)選擇渦旋提取方式。

表2 不同提取方式的提取結(jié)果(n=3)Table 2 Results of different extraction methods(n=3)

2.1.3 提取時(shí)間的選擇

乙酸乙酯渦旋提取30 s、1、3、5、10 min的結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，提取30 s蘿卜硫素含量較低，提取1、3、5、10 min結(jié)果沒(méi)有顯著性差異(P<0.05)，可見(jiàn)，提取1 min即可以提取完全，實(shí)驗(yàn)選擇渦旋提取1 min，重復(fù)提取2次的提取方式。

表3 不同提取時(shí)間的提取結(jié)果(n=3)Table 3 Results of different extraction time(n=3)

2.2 水解條件的選擇

2.2.1 水解溶液的選擇

不同水解溶液對(duì)西蘭花中蘿卜硫素的提取效果見(jiàn)表4。由表4可知，pH=3.0鹽酸水溶液對(duì)西蘭花中蘿卜硫素的提取效果最佳，這與BERTELLI等[21]和張品南等[22]研究相吻合。

表4 不同水解溶液的水解結(jié)果(n=3)Table 4 Results of different hydrolytic solutions(n=3)

2.2.2 水解時(shí)間的選擇

由表5可知，pH=3.0鹽酸水溶液45 ℃水解0.5～4.0 h，所得蘿卜硫素含量沒(méi)有顯著性差異，水解6.0 h，蘿卜硫素含量明顯降低，可見(jiàn)，水解0.5 h即可以水解完全，水解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致蘿卜硫素的降解。

表5 不同水解時(shí)間的水解結(jié)果(n=3)Table 5 Results of different hydrolytic time(n=3)

2.2.3 水解溫度的選擇

由表6可知，25、35和45 ℃水解0.5 h，西蘭花中蘿卜硫素的含量沒(méi)有顯著性差異，55 ℃水解0.5 h蘿卜硫素含量明顯降低，可見(jiàn)，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致蘿卜硫素的降解，西蘭花中蘿卜硫素25 ℃水解0.5 h 即可以水解完全。

表6 不同水解溫度的水解結(jié)果(n=3)Table 6 Results of different temperatures(n=3)

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限

將蘿卜硫素的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照實(shí)驗(yàn)色譜條件依次進(jìn)樣，根據(jù)濃度與峰面積的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，在2.00～100.00 μg/mL范圍內(nèi)，蘿卜硫素的濃度與峰面積有良好線性關(guān)系，蘿卜硫素的線性回歸方程為y=21.168x，回歸系數(shù)大于0.999，說(shuō)明回歸方程擬合性好，檢出限為0.80 μg/g，定量限為2.50 μg/g。蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)溶液和西蘭花樣品的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of sulforaphane

2.3.2 方法精密度實(shí)驗(yàn)

按實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最佳提取方式和色譜條件，平行測(cè)定6次，西蘭花和圓紅蘿卜中蘿卜硫素的含量見(jiàn)表7。

圖2 西蘭花中蘿卜硫素色譜圖Fig2 HPLC chromatograms of sulforaphane in broccoli

由表7知，西蘭花和圓紅蘿卜中蘿卜硫素含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%，滿(mǎn)足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[20]要求，表明方法精密度良好。

表7 方法精密度結(jié)果(n=6)Table 7 Results of precision(n=6)

2.3.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

西蘭花和圓紅蘿卜中蘿卜硫素3水平3平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8，由表8可知，西蘭花中蘿卜硫素的回收率在95.23%～105.55%，平均回收率為100.09%，圓紅蘿卜中蘿卜硫素的回收率在90.88%～99.52%，平均回收率為96.16%，RSD均小于5%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表8 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 8 Results of recovery rate by standard addition(n=3)

2.4 檢測(cè)方法的應(yīng)用

選取9種十字花科蔬菜按照實(shí)驗(yàn)建立的方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，菜心和紫甘藍(lán)中蘿卜硫素的含量較高，大白菜和小白菜中蘿卜硫素含量相近，青梗菜花、薺菜和胡蘿卜中未檢測(cè)到蘿卜硫素，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 十字花科蔬菜中蘿卜硫素的含量(n=3)Table 9 Contents of sulforaphane in cruciferous vegetables (n=3)

3 結(jié)論

本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)西蘭花中蘿卜硫素的提取條件和酶解條件進(jìn)行優(yōu)化處理，以蘿卜硫素得率高低作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到蘿卜硫素的最佳前處理?xiàng)l件為10.0 mL pH=3.0的鹽酸水溶液25 ℃水解0.5 h，冷卻至室溫后，加入 20 mL乙酸乙酯渦旋提取1 min，4 ℃條件下5 000 r/min離心5 min，重復(fù)提取2次，45 ℃條件下旋轉(zhuǎn)至干，5 mL乙腈定容，過(guò)0.45 μm濾膜后供液相色譜測(cè)定。分別稱(chēng)取西蘭花和圓紅蘿卜樣品，按照實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的方法，平行測(cè)定6次，計(jì)算蘿卜硫素的含量，結(jié)果顯示，西蘭花和圓紅蘿卜中蘿卜硫素精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.64%和1.33%，均小于5%；向西蘭花和圓紅蘿卜中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行3水平3平行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，西蘭花中蘿卜硫素的回收率范圍在95.23%～105.55%，平均回收率為100.09%，圓紅蘿卜中蘿卜硫素的回收率在90.88%～99.52%，平均回收率為96.16%，RSD均小于5%，表明添加回收率高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小，實(shí)驗(yàn)建立的方法適合十字花科蔬菜中蘿卜硫素的含量的測(cè)定。