高效液相色譜法測定十字花科蔬菜中蘿卜硫素的含量

孔凡華，楊春雪，方從容，邱楠楠，徐佳佳，白沙沙，李東，崔亞娟*

1(北京市營養源研究所，北京，100069)2(國家食品安全風險評估中心，國家衛生健康委員會食品安全風險評估 重點實驗室，北京，100021)

蘿卜硫素(sulforaphane, SFN)又稱“萊菔硫烷”，廣泛存在于十字花科植物類[1]，是目前防癌抗癌效果最好的植物天然產物之一，是自然界存在的誘導II型解毒酶能力最強的誘導物，可以抑制并殺死癌細胞[2]，可顯著降低肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌等癌癥的發生[3-7]。SFN具有抗菌、提高機體抗氧化能力和免疫力等藥理作用，在預防和治療糖尿病、心腦血管疾病等方面也具有重要的藥用價值[8-9]。國內尚沒有建立十字花科蔬菜中蘿卜硫素檢測的標準方法，文獻中的提取方法仍存在一些爭議，如SIVAKUMAR等[10]認為在0.1 mol/L鹽酸條件下提取效果較好，隨后RENATO等[11]致信編輯部，質疑pH 1.0 是否可以提高葡萄糖苷釋放萊蘿卜硫素的效率。NATHAN等[12]認為水解8 h可以充分獲得蘿卜硫素，這樣提取耗時較長，ZHANG等[13]認為超聲處理可提高提取效率，減少水解時間，因此，如何準確定量十字花科蔬菜中蘿卜硫素的含量還有待研究。蘿卜硫素的檢測方法有熒光誘導毛細管電泳法、生物傳感法、化學測定法和色譜方法，色譜方法包括氣相色譜法、高效液相色譜法和質譜聯用法[14-18]。化學法步驟繁瑣，費時費力，分析結果靈敏度較低，由于蘿卜硫素性質不穩定，氣相色譜法高溫會破壞蘿卜硫素的結構，本研究在前人研究的基礎上，設計單因素實驗，對十字花科蔬菜中蘿卜硫素的提取試劑、提取方式、水解條件進行優化處理，以蘿卜硫素含量的高低作為評價指標，篩選最佳前處理條件。以西蘭花、圓紅蘿卜為研究對象，進行方法學驗證，考察方法的科學性、準確性和適用性，以期建立十字花科蔬菜中蘿卜硫素的準確分析檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西蘭花、圓紅蘿卜、芥蘭、花椰菜、圓白菜、紫甘藍、大白菜、小白菜、菜心、胡蘿卜、薺菜,超市購買；蘿卜硫素(純度95%，Cas：4478-93-7)，大連美侖生物技術有限公司；甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈(均為色譜純)，美國Fisher公司；丙酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；濃鹽酸(分析純)，北京化工廠。

BS224S分析天平，德國賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；METTLER TOLEDO pH計，梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；IKA VORTEX 3渦旋振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ZHWY-110X30往復式恒溫水浴搖床，上海智誠分析儀器制造有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超市儀器有限公司；HITACHI CF16RXII 高速冷凍離心機，日本日立科技有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器和ChemStation for LC systems色譜工作站)，美國Agilent公司；C18色譜柱[5 μm，150 mm×4.6 mm(內徑)]，美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取蘿卜硫素標準品20 mg，置于10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，得到濃度為2.00 mg/mL標準儲備液，現用現配。

1.2.2 提取條件的選擇

1.2.2.1 提取溶劑的選擇

稱取2.0 g(精確至0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL離心管中，參考趙登奇等[19]的方法，分別加入10.0 mL pH=6.0的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后于45 ℃水浴2.5 h，冷卻至室溫后，分別加入20 mL二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈超聲提取(功率為100 W，25 ℃)10 min，4 ℃條件下5 000 r/min離心5 min，有機層經無水硫酸鈉濾入150 mL旋轉蒸發瓶中，重復提取2次，45 ℃條件下旋轉至干，5 mL乙腈定容，過0.45 μm濾膜后供液相色譜測定。

1.2.2.2 提取方式的選擇

稱取2.0 g(精確至0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL離心管中，分別加入10.0 mL pH=6.0的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后于45 ℃水浴2.5 h，冷卻至室溫后，分別加入 20 mL乙酸乙酯超聲提取(功率為100 W，25 ℃)、振蕩提取(180 r/min)和渦旋提取10 min，其他操作步驟同1.2.2.1。

1.2.2.3 提取時間的選擇

稱取2.0 g(精確至0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL 離心管中，分別加入10.0 mL pH=6.0的磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后于45 ℃水浴2.5 h，冷卻至室溫后，分別加入 20 mL乙酸乙酯渦旋提取30 s、1、3、5、10 min，其他操作步驟同1.2.2.1。

1.2.3 水解條件的選擇

1.2.3.1 水解溶液的選擇

稱取2.0 g(精確至0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL離心管中，分別加入10.0 mL pH=1.0鹽酸水溶液、pH=2.0鹽酸水溶液、pH=3.0鹽酸水溶液、pH=4.0鹽酸水溶液、pH=5.0鹽酸水溶液、pH=5.0磷酸緩沖液、pH=6.0磷酸緩沖液和去離子水，混合均勻后于45 ℃水浴2.5 h，冷卻至室溫后，分別加入20 mL乙酸乙酯渦旋提取1 min，其他操作步驟同1.2.2.1。

1.2.3.2 水解時間的選擇

稱取2.0 g(精確至 0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL離心管中，分別加入10.0 mL pH=3.0鹽酸水溶液，混合均勻后于45 ℃水浴0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0 h，冷卻至室溫后，分別加入20 mL乙酸乙酯渦旋提取1 min，其余步驟同1.2.2.1。

1.2.3.3 水解溫度的選擇

稱取2.0 g(精確至0.000 1 g)西蘭花樣品，置于50 mL離心管中，分別加入10.0 mL pH=3.0鹽酸水溶液，混合均勻后于25、35、45、55 ℃水浴0.5 h，冷卻至室溫后，分別加入20 mL乙酸乙酯渦旋提取1 min，其余步驟同1.2.2.1。

1.2.4 色譜測定條件

色譜柱：C18色譜柱[5 μm，150 mm×4.6 mm(內徑)]；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-水(20∶80，體積比)；流速：1 mL/min；檢測波長201 nm；進樣量：10 μL。

1.2.5 方法驗證

按照GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[20]方法學要求，建立校準曲線及校準曲線的工作范圍；逐步稀釋樣品上機測定，R(S/N)=3時的測定濃度作為檢出限，R(S/N)=10時的測定濃度作為定量限；分別稱取西蘭花和圓紅蘿卜，按照實驗優化的方法，平行測定6次，計算蘿卜硫素的含量，并計算相對標準偏差，考察方法的重現性；向樣品本底添加低、中、高3個濃度水平的標準溶液，進行3水平3平行加標回收實驗，以回收率的高低評價方法的準確度。

1.2.6 檢測方法的應用

選擇具有代表性樣品，包括芥蘭、花椰菜、圓白菜、紫甘藍、大白菜、小白菜、菜心、胡蘿卜、薺菜等，按照實驗建立方法，對蘿卜硫素定量測定，所有樣品平行測定3次，結果以均值±標準差表示。

1.2.7 蘿卜硫素含量的計算

1.2.7.1 標準曲線的制作

取蘿卜硫素標準儲備液，配制成2.00、4.00、8.00、20.00、40.00、100.00 μg/mL的系列標準工作液，搖勻，現用現配。將標準系列工作液分別注入高效液相色譜儀中，測定相應的峰面積，以峰面積為縱坐標，以標準系列工作液濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程和相關系數。

1.2.7.2 結果計算

試樣中蘿卜硫素的含量按公式(1)計算：

(1)

式中：X,試樣中蘿卜硫素的含量，mg/100g；C,根據標準曲線計算得到的試樣中蘿卜硫素的質量濃度，μg/mL；m,試樣的稱樣量，g；V,定容液的體積，mL。

1.3 數據處理

通過與儀器配套的 ChemStation for LC systems工作站軟件完成數據的采集與處理。

2 結果與分析

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 提取溶劑的選擇

本試驗根據前人研究成果選取5種不同提取溶劑，比較不同提取溶劑對西蘭花中蘿卜硫素的提取效果，結果見表1。結果顯示，乙酸乙酯對西蘭花中蘿卜硫素的提取效果最佳，實驗選擇乙酸乙酯作為蘿卜硫素的提取試劑。

表1 不同提取溶劑的提取結果(n=3)Table 1 Results of different extraction solvents(n=3)

2.1.2 提取方式的選擇

超聲提取、振蕩提取和渦旋提取對西蘭花中蘿卜硫素的提取效果見表2。結果顯示，渦旋提取對西蘭花中蘿卜硫素的提取效果最佳，這可能是因為渦旋的高速旋轉可以更好地促進樣品和提取溶劑的混合，使蘿卜硫素的提取效率更高，故實驗選擇渦旋提取方式。

表2 不同提取方式的提取結果(n=3)Table 2 Results of different extraction methods(n=3)

2.1.3 提取時間的選擇

乙酸乙酯渦旋提取30 s、1、3、5、10 min的結果見表3。結果表明，提取30 s蘿卜硫素含量較低，提取1、3、5、10 min結果沒有顯著性差異(P<0.05)，可見，提取1 min即可以提取完全，實驗選擇渦旋提取1 min，重復提取2次的提取方式。

表3 不同提取時間的提取結果(n=3)Table 3 Results of different extraction time(n=3)

2.2 水解條件的選擇

2.2.1 水解溶液的選擇

不同水解溶液對西蘭花中蘿卜硫素的提取效果見表4。由表4可知，pH=3.0鹽酸水溶液對西蘭花中蘿卜硫素的提取效果最佳，這與BERTELLI等[21]和張品南等[22]研究相吻合。

表4 不同水解溶液的水解結果(n=3)Table 4 Results of different hydrolytic solutions(n=3)

2.2.2 水解時間的選擇

由表5可知，pH=3.0鹽酸水溶液45 ℃水解0.5～4.0 h，所得蘿卜硫素含量沒有顯著性差異，水解6.0 h，蘿卜硫素含量明顯降低，可見，水解0.5 h即可以水解完全，水解時間過長會導致蘿卜硫素的降解。

表5 不同水解時間的水解結果(n=3)Table 5 Results of different hydrolytic time(n=3)

2.2.3 水解溫度的選擇

由表6可知，25、35和45 ℃水解0.5 h，西蘭花中蘿卜硫素的含量沒有顯著性差異，55 ℃水解0.5 h蘿卜硫素含量明顯降低，可見，溫度過高會導致蘿卜硫素的降解，西蘭花中蘿卜硫素25 ℃水解0.5 h 即可以水解完全。

表6 不同水解溫度的水解結果(n=3)Table 6 Results of different temperatures(n=3)

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系、檢出限及定量限

將蘿卜硫素的標準工作溶液，按照實驗色譜條件依次進樣，根據濃度與峰面積的關系繪制標準曲線，結果表明，在2.00～100.00 μg/mL范圍內，蘿卜硫素的濃度與峰面積有良好線性關系，蘿卜硫素的線性回歸方程為y=21.168x，回歸系數大于0.999，說明回歸方程擬合性好，檢出限為0.80 μg/g，定量限為2.50 μg/g。蘿卜硫素標準溶液和西蘭花樣品的高效液相色譜圖見圖1和圖2。

圖1 蘿卜硫素標準溶液色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of sulforaphane

2.3.2 方法精密度實驗

按實驗優化的最佳提取方式和色譜條件，平行測定6次，西蘭花和圓紅蘿卜中蘿卜硫素的含量見表7。

圖2 西蘭花中蘿卜硫素色譜圖Fig2 HPLC chromatograms of sulforaphane in broccoli

由表7知，西蘭花和圓紅蘿卜中蘿卜硫素含量的相對標準偏差(RSD)均小于5%，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[20]要求，表明方法精密度良好。

表7 方法精密度結果(n=6)Table 7 Results of precision(n=6)

2.3.3 加標回收率實驗

西蘭花和圓紅蘿卜中蘿卜硫素3水平3平行加標回收實驗結果見表8，由表8可知，西蘭花中蘿卜硫素的回收率在95.23%～105.55%，平均回收率為100.09%，圓紅蘿卜中蘿卜硫素的回收率在90.88%～99.52%，平均回收率為96.16%，RSD均小于5%，表明方法準確度良好。

表8 加標回收率實驗結果(n=3)Table 8 Results of recovery rate by standard addition(n=3)

2.4 檢測方法的應用

選取9種十字花科蔬菜按照實驗建立的方法進行測定，結果表明，菜心和紫甘藍中蘿卜硫素的含量較高，大白菜和小白菜中蘿卜硫素含量相近，青梗菜花、薺菜和胡蘿卜中未檢測到蘿卜硫素，結果見表9。

表9 十字花科蔬菜中蘿卜硫素的含量(n=3)Table 9 Contents of sulforaphane in cruciferous vegetables (n=3)

3 結論

本研究在前人研究的基礎上，設計單因素實驗，對西蘭花中蘿卜硫素的提取條件和酶解條件進行優化處理，以蘿卜硫素得率高低作為評價指標，得到蘿卜硫素的最佳前處理條件為10.0 mL pH=3.0的鹽酸水溶液25 ℃水解0.5 h，冷卻至室溫后，加入 20 mL乙酸乙酯渦旋提取1 min，4 ℃條件下5 000 r/min離心5 min，重復提取2次，45 ℃條件下旋轉至干，5 mL乙腈定容，過0.45 μm濾膜后供液相色譜測定。分別稱取西蘭花和圓紅蘿卜樣品，按照實驗優化的方法，平行測定6次，計算蘿卜硫素的含量，結果顯示，西蘭花和圓紅蘿卜中蘿卜硫素精密度的相對標準偏差分別為1.64%和1.33%，均小于5%；向西蘭花和圓紅蘿卜中添加低、中、高3個濃度水平的標準溶液，進行3水平3平行加標回收實驗，結果顯示，西蘭花中蘿卜硫素的回收率范圍在95.23%～105.55%，平均回收率為100.09%，圓紅蘿卜中蘿卜硫素的回收率在90.88%～99.52%，平均回收率為96.16%，RSD均小于5%，表明添加回收率高，相對標準偏差小，實驗建立的方法適合十字花科蔬菜中蘿卜硫素的含量的測定。