QuEChERS結合超高效液相色譜串聯質譜法測定花椒中烯效唑殘留量及貯藏穩定性

范金平,張盈，魏進*,羅世霞,段婷婷*

1(貴州師范大學 化學與材料科學學院，貴州 貴陽，550025)2(貴州省農業科學院植物保護研究所，貴州 貴陽，550009)

香辛料是指在菜品中起調香、調味、著色的植物香料，具有香、辛、麻、辣等特點，其在日常生活中是不可缺少的調味料。花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxin)是香辛料的一種，屬蕓香科落葉小喬木或灌木，是我國“八大調味品”之一，也是一種中藥材，有殺蟲、散寒、除濕的功效[1]。

烯效唑(uniconazole)又名特效唑，結構式見圖1，是一種光譜性唑類植物生長調節劑，赤霉素合成抑制劑，具有控制營養生長，抑制細胞伸長，縮短節間、矮化植株，促進側芽生長和花芽形成的作用[2]，因此能提高作物的抗倒伏能力，提高產量，改善品質[3-4]。由于目前在水稻、花生、小麥、大豆、大麥等作物上的廣泛應用，造成在植物源性食品中該類農藥的殘留。如果食用，短時間內影響不明顯，但如果長時間攝入會對人體的血液、肝臟，腎臟造成危害[5]，導致人體代謝失調，誘發多種疾病[6]，并可能引起癌變。

我國對烯效唑的最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)只在谷物類和油料油脂類上規定，在花椒上暫時沒有制定[7]，歐盟(European Union,EU)和國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission,CAC)均未制定烯效唑在農產品中的MRL值。目前關于烯效唑殘留檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[8]、高效液相色譜法(HPLC)[9-10]、氣質聯用法(GC-MS)[11]、液質聯用法(HPLC-MS/MS)[12]和超高效液相色譜串聯質譜法(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectromentry，UPLS-MS/MS)[3,13]等；GC和GC-MS需要更換溶劑，操作比較復雜；HPLC受基質干擾較大；HPLC-MS/MS具備樣品前處理簡單、靈敏度高、定性能力好等特點。上述方法主要涉及水果、蔬菜、煙草等，而檢測花椒中烯效唑殘留方法以及烯效唑在花椒中的貯藏穩定性未見報道。于是，本研究運用了改進的QuEChERS選用不同提取劑(乙腈、含有體積分數0.1%乙酸的乙腈)、不同種類的凈化劑(PSA、C18、C18+GCB、PSA+GCB)，結合UHPLC-MS/MS分析方法檢測鮮花椒、干花椒中烯效唑殘留，同時研究花椒中烯效唑在冷凍條件下的貯藏穩定性。本文通過優化質譜參數和色譜條件，考察了不同流動相、不同前處理方法及基質效應等因素，建立了UPLC-MS/MS法檢測花椒中烯效唑殘留以及烯效唑在花椒中的貯藏穩定性。為烯效唑在花椒中殘留監控和質量安全評價提供技術支撐，同時為中國制定花椒中烯效唑的合理使用準則以及其MRL標準提供數據依據。

圖1 烯效唑結構式Fig.1 The structural formula of uniconazole

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

烯效唑(98.7%)標準品，國家農藥產品質檢中心；乙腈(色譜純)，德國默克公司；乙腈(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司；甲酸(色譜純)，美國Thermo Fisher科技有限公司；乙酸(分析純)，天津市光復科技發展有限公司；實驗用水為屈臣氏蒸餾水。

UItimate 3000/TSQ Vantage型超高效液相色譜-串聯質譜，美國Thermo Fisher 公司；Hypersil GOLD 型C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，賽默飛科技(中國)有限公司；CK200型高通量組織研磨器，北京托摩根生物有限公司；電子分析天平(精度為0.000 1 g)，德國Sartorius公司；多管渦旋儀，杭州瑞誠儀器有限公司；TG16-11型臺式高速離心機，湖南平凡科技有限公司；0.22 μm有機濾膜，日本島津公司。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取烯效唑標準品0.010 1 g (精確到0.000 1 g)，用色譜純乙腈配制10 mL 1 000 mg/L的標準儲備液，保存于4 ℃冰箱中。取烯效唑標準儲備液適量，用色譜純乙腈稀釋制得烯效唑標準工作溶液，標準工作液濃度分別為2.0、0.8、0.2、0.08 mg/L。

1.3 設計試驗

根據NT/T3094—2017《植物源農產品中農藥殘留儲藏穩定性試驗準則》[14]設計試驗。花椒中烯效唑的貯藏穩定性試驗是在空白花椒樣品加入一定質量濃度的烯效唑，再將樣品放入-20 ℃冰箱中保存，不同貯藏時期時對樣品進行檢測，測定花椒中烯效唑的穩定性。

1.3.1 制備貯藏穩定性試驗樣品

稱取2.0 g空白花椒樣品于50 mL離心管中，準確加入0.5 mL 2.0 mg/L的烯效唑溶劑標準溶液，蓋上蓋子后混勻，每個貯藏期取2個樣品及3個空白樣品，2 h內放入-20 ℃冰箱中貯藏。

1.3.2 質控樣品

質控樣品是在空白樣品中加入與貯藏樣品體積相同、質量濃度相同的溶劑標準溶液，每個時期設置2個質控樣品。

1.4 樣品的檢測

1.4.1 樣品前處理

準確稱取2.00 g(精確到0.01 g)均質花椒試樣于50 mL塑料離心管，加入2.0 mL屈臣氏蒸餾水和20 mL含0.1%(體積分數)乙酸的乙腈溶液，渦旋振蕩1 h，加入2.00 g無水MgSO4、1.00 g NaCl混勻，渦旋振蕩10 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液1.0 mL到2 mL 離心管(裝有25 mg PSA和100 mg GCB)中，渦旋2 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm的有機濾膜，取濾液接體積比1∶1加屈臣氏蒸餾水后供UPLC-MS/MS測定。

1.5 色譜與質譜條件

Hypersil GOLD 型C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流速：0.25 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相：A為乙腈，B為0.1%的甲酸水；洗脫程序：0～0.5 min 80% B；0.5～1.0 min 80%～5% B；1.0～4.0 min 5% B；4.0～4.5 min 5%～80% B；4.5～5.0 min 80% B。

ESI離子源，掃描方式為MRM多反應監測，毛細管電壓：3.2 kV，離子源溫度：350 ℃，脫溶劑溫度：330 ℃，輔助氣(N2)流速：10 arb，鞘氣(N2)流速：30 arb，碰撞氣為氬氣。烯效唑定性、定量離子對等質譜分析參數見表1。

表1 烯效唑的保留時間及質譜分析參數Table 1 Retention times and MS/MS parameters of uniconazole

1.6 基質效應

由于液質聯用以及花椒基質的復雜性，考察了基質效應(matrix effect，ME)的影響。采用標準曲線測定法來測定花椒的基質效應即分析了空白花椒基質標準溶液和純溶劑標準溶液，繪制標準曲線，以二者的斜率比來判定基質效應的強弱[15],如公式(1)所示：

(1)

式中:Sm為基質標準曲線的斜率，Ss為溶劑標準曲線的斜率[15]。

當ME為0時，表明不存在基質效應的影響；當ME為-20%～20%時表明存在弱基質效應；當ME為-50%～-20%或20%～50%時表明存在中等基質效應；當ME≤-50%或>50%時表明存在強基質效應[16]。

2 結果與分析

2.1 色譜、質譜條件的確定

烯效唑結構中含有羥基易于離子化，適合采用ESI源。試驗采用直接進樣方式，在ESI+模式下找到烯效唑母離子，然后通過碰撞能量的調節選擇相對豐度較高的特征離子作為定量離子和定性離子，分析時再結合化合物的保留時間，進行定性、定量分析；烯效唑離子對及其對應的質譜參數見表1。

烯效唑在C18色譜柱上保留效果好，采用梯度洗脫，提高單位樣品的分析效率并減少了強保留雜質在色譜柱的積累。試驗選擇了甲醇-0.1%甲酸水溶液， 0.1%甲酸水-乙腈組成的流動相體系，研究了不同流動相對烯效唑洗脫效果的影響。以乙腈-0.1%甲酸水為流動相時，烯效唑能獲得較好的色譜峰和穩定的信號強度。因此流動相采用0.1%甲酸水-乙腈。

2.2 凈化方法的選擇

2.2.1 提取劑的選擇

QuEChERS方法中，乙腈為常用的提取溶劑[17]，溶解性能好，能夠溶解有機、無機以及氣體等多種物質。由于農藥結構的不同，不同pH下對提取效果影響較大，實驗人員在乙腈中加入不同比例的試劑，如乙酸，取得了更好的回收率[18-20]。本實驗提取溶劑選擇乙腈、0.1%乙酸乙腈，比較花椒中烯效唑的加標回收率，結果表明以乙腈為提取溶劑時，鮮花椒、干花椒中烯效唑的平均回收率分別為62.71%、65.43%，低于NY788—2018標準中所允許的回收率范圍(70%～120%)[21]；以0.1%乙酸乙腈為提取溶劑時，鮮花椒、干花椒中烯效唑的平均回收率分別為84.12%、71.50%；因此選擇0.1%乙酸乙腈為提取溶劑。采用不同提取劑(n=6)時，鮮花椒、干花椒中烯效唑的回收率如圖2-A。

2.2.2 凈化劑的選擇

PSA吸附結構中含2個氨基，屬于氨基吸附劑，通過氫鍵能夠除去有機酸、脂肪酸、糖等物質；C18是一種非極性、廣譜性的凈化劑，能有效去除提取液中微量的非極性雜質；GCB吸附劑表面有極強的吸附性，能夠去除色素。分別以PSA、C18、C18+ GCB，PSA+GCB為凈化劑比較其回收率。鮮花椒采用PSA+GCB為凈化劑時烯效唑的平均回收率(84.12%)優于PSA、C18、C18+GCB為凈化劑時烯效唑的平均回收率(63.53%、64.82%、68.64%)，干花椒采用PSA+GCB為凈化劑時烯效唑的平均回收率(71.50%)優于PSA、C18、C18+GCB為凈化劑時烯效唑的平均回收率(66.53%、64.83%、68.92%)，采用不同凈化劑時(n=6)，鮮花椒、干花椒中烯效唑添加回收率如圖2-B。

A-不同提取劑；B-不同凈化劑圖2 不同提取劑、凈化劑鮮花椒和干花椒中烯效唑 加標回收率Fig.2 Recovery rates of uniconazole in fresh Zanthoxylum bungeanum Maxim and dried Zanthoxylum bungeanum Maxim with different extracting solution and purifying agent

2.3 基質效應、方法的線性范圍與定量限

采用鮮花椒、干花椒基質空白溶液及溶劑配制烯效唑質量濃度為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng/mL的標準溶液，在優化的實驗條件下測定，橫坐標(x)為標準溶液的質量濃度(ng/mL)，縱坐標(y)為相應的峰面積，繪制標準曲線，烯效唑的回歸方程和相關系數見表2。結果顯示，烯效唑在1.0～50.0 ng/mL均呈良好的線性關系，相關系數(R2)為0.993 7～0.999 7。通過添加回收實驗，以最小添加濃度作為方法的定量限(limit of quantitation,LOQ)，烯效唑方法LOQ為0.02 mg/kg。

表2 烯效唑的基質效應、回歸方程、R2和LOQTable 2 Matrix effects、regression equations、R2 and LOQ of uniconazole

2.4 添加回收試驗結果

結果(表3)顯示，在0.02、0.05、0.2 mg/kg 3個添加水平下，鮮花椒、干花椒中烯效唑的回收率在71.50%～85.98%，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)在1.13%～5.36%，表明本方法均有較好的精密度和準確度，符合農藥殘留分析的要求。鮮花椒 (加標濃度0.2 mg/kg)的MRM圖譜如圖3所示。

表3 鮮花椒、干花椒中烯效唑的加標回收率和RSD (n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSD of fresh Zanthoxylum bungeanum Maxim、dried Zanthoxylum bungeanum Maxim(n=6)

A-鮮花椒空白；B-0.01 mg/kg烯效唑溶劑標；C-0.2 mg/kg鮮花椒添加；D-鮮花椒樣品添加圖3 空白鮮花椒基質，烯效唑溶劑標和鮮花椒添加，鮮花椒樣品添加色譜圖Fig.3 Chromatography of fresh Zanthoxylum bungeanum Maxim blank, uniconazole solvent standard and matrix standard, sample with uniconazole in fresh Zanthoxylum bungeanum

2.5 烯效唑在花椒中的貯藏穩定性及實際樣品分析

應用本研究所建立的方法，測定花椒中烯效唑不同貯藏時間烯效唑的降解率，烯效唑的平均降解率<30%，說明烯效唑在-20 ℃貯藏是穩定的，結果如表4所示。并對貴州省試驗點施用烯效唑的鮮花椒、干花椒末次施藥后70、80、110 d 3個時間點的樣品進行了檢測，結果如表5所示。

3 結論

本文建立了同時檢測鮮花椒、干花椒2種基質中烯效唑的一種簡便可靠的殘留分析方法。樣品前處理簡單，根據農藥殘留分析的要求，該方法的各種性能指標(LOQ、線性范圍、平均添加回收率)均能滿足要求；烯效唑的定量限為0.02 mg/kg，在0.02、0.05、0.20 mg/kg 3個加標水平下平均回收率為71.50%～85.98%，RSD為1.13%～5.36%。該方法適用于花椒中烯效唑多殘留的快速、準確定性和定量分析。

表4 不同時期鮮花椒和干花椒中烯效唑殘留量及降解率 單位：%

表5 烯效唑在鮮花椒和干花椒中的殘留量 單位：mg/kg

用該方法測定了烯效唑在花椒中的貯藏穩定性，結果表明在-20 ℃冷凍條件下烯效唑在花椒中的平均消解率為12.34%～26.59%，均不超過30%。因此，花椒中烯效唑在-20 ℃至少能穩定貯藏5個月。