等溫擴增技術在食源性致病菌檢測中的研究進展

董晶，盧鑫，郭威，楊倩，張偉,,3*

1(河北農業大學 食品科技學院，河北 保定，071001)2(河北農業大學 理工學院，河北 滄州，061100) 3(河北農業大學 生命科學學院，河北 保定，071001)

食源性致病菌的檢測是預防與控制食源性疾病的關鍵步驟之一。傳統培養方法公認度高，穩定性好，但檢測周期較長，耗時費力[1]。因此加強對食源性病原菌的快速檢測與篩查對保障食品安全至關重要。隨著分子生物學技術的不斷發展，核酸檢測技術成為近年來研究熱點之一，最早開發的PCR技術及其拓展技術在食源性致病菌的檢測與鑒定中發揮著重要的作用，但該技術需經歷反復的升降溫過程，對設備要求高。隨后等溫擴增技術逐漸發展起來，在恒定溫度下即可反應，擺脫了對精密溫度循環設備的依賴。

目前常用的等溫擴增技術包括環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、鏈替代等溫擴增(strand displacement amplification，SDA)、單引物等溫擴增(single primer isothermal amplification，SPIA)、滾環等溫擴增(rolling circle amplification，RCA)以及河北農業大學生物檢測技術創新團隊自主開發的跨越式滾環等溫擴增(saltatory rolling circle amplification，SRCA)等。

核酸等溫擴增技術依據檢測目標不同可分為“目標放大”和“信號放大”兩類，LAMP、SDA、SPIA以及SRCA均屬于目標放大擴增技術；RCA則歸類于信號放大技術。以擴增對象的不同可分為“DNA擴增”和“RNA擴增”兩大類，上述5種等溫擴增方法均屬于DNA擴增。本文綜合國內外相關報道，對上述5種技術的研究進展以及存在的共性問題進行簡要概述，并提出改進措施，為食源性致病菌的快速檢測與篩查以及食源性疾病的預防與控制提供了參考依據。

1 環介導等溫擴增技術

LAMP最早由日本學者NOTOMI等[2]開發。該方法依靠具有強鏈置換活性的BstDNA聚合酶和4～6條特異性引物在60～65 ℃恒定溫度下進行擴增，對設備要求低，基于LAMP技術的一些拓展技術已成功應用于食源性致病菌的檢測[3]。相興偉等[4]利用雙重LAMP法同時檢測海產品中的霍亂弧菌和副溶血性弧菌，檢出限均為50 CFU/mL；還可通過觀察產物濁度判定結果，提高檢測效率。CHUN等[5]將LAMP方法和回射Janus粒子(retroreflective Janus particle,RJP)相結合開發了一種基于LAMP技術的傳感器方法用于檢測沙門氏菌，通過RJP的數目定量分析LAMP產物的濃度，檢測限達到了102CFU/mL。

LAMP方法具有極高的特異性，不易受非靶基因的影響，若向體系中加入環引物，反應時間可縮短一半[6]。但用凝膠電泳法觀察擴增產物時較為模糊，且易受氣溶膠污染[7-8]。LAMP反應引物數量多，引物間易相互作用，影響擴增結果的準確性，且LAMP產物結果分析僅能判斷是否擴增，無法對產物的來源以及產物的特異性進行分析。

2 鏈置換等溫擴增技術

SDA技術于1992年由WALKER等[9]開發。該技術的核心是利用限制性內切酶識別并切割DNA鏈上的特定位點，打開缺口，被切割下來DNA鏈的3′端在聚合酶的作用下不斷延伸，并將下游序列置換下來，在等溫條件下成幾何倍數級聯擴增。有研究表明SDA-DNA傳感器技術與qPCR方法及常規方法相比更加快速、準確[10]。WU等[11]將SDA與免疫層析結合用于檢測食品中的大腸桿菌O157：H7，檢測限為10 CFU/mL，僅捕獲在細胞膜上的適體，降低假陽性結果發生的概率，且無需進行DNA提取，操作更加簡便、快捷。鄧世瓊等[12]利用缺口酶Nt.BstNBI替代限制性內切酶用于SDA反應，不僅解決了傳統鏈置換技術中要使用修飾底物的問題，還大大降低了成本，對于質粒檢測的靈敏度低至2 pmol/L。

隨著對SDA技術研究的不斷深入，該技術也暴露出一些不足之處，SDA反應體系中的dNTP大多需進行加工修飾，且靶序列的長度一般不超過200 bp；此外，SDA的擴增產物序列兩端含有內切酶的識別序列或其殘端，無法進行克隆；產物不均一易出現拖帶現象等。

3 單引物等溫擴增技術

SPIA技術是近些年報道的一種新的核酸等溫擴增技術[13]，產物為單鏈DNA，已成功應用于食源性致病菌的檢測[14]。YANG等[15]利用SPIA技術快速檢測蘋果汁中的酸曲霉，檢出限低至4.8 CFU/mL。GUO等[16]將SPIA與快速等溫檢測分析相結合用于檢測B組鏈球菌DNA，檢出限低至102copies/mL。可在不開蓋的情況下在紫外輻射下直觀判定結果，由于產物不能用作擴增目標，因此在一定程度上可避免氣溶膠污染，操作簡單、快速、靈敏，適用于基層企業機構。

SPIA技術引物數量少、擴增效率高，SPIA擴增產物因缺少大部分5′端引物區序列使產物DNA無法與引物發生結合，可減少擴增產物的污染。但雜合引物的設計與合成相對復雜，且不能對擴增反應進行實時定量分析，需對起始模板量定量時，只能通過其他方法如熒光定量PCR進行分析。

4 滾環等溫擴增技術

RCA是于1995年被開發的一種核酸等溫擴增技術[17-19]，可分為線性擴增和指數擴增兩類[20]，其目的序列的檢測也有兩種方式，當模板為環狀單鏈DNA時，直接檢測擴增信號即可[21]；當模板為線性單鏈DNA時，則需利用鎖式探針和連接酶對模板進行人為環化，繼而檢測擴增信號。有研究表明適配體探針可增強RCA的擴增信號[22]。TENG等[23]利用適配體/免疫組合的電化學生物傳感器模型檢測海產品中的副溶血性弧菌，檢測限低至2 CFU/mL，且在不同生產批次的電極上重復性良好。GE等[24]將金納米顆粒沉積在電極上，同時結合RCA技術將靶物質和適體結合的信號特異性放大，實現鼠傷寒沙門氏菌的超靈敏檢測，檢出限低至16 CFU/mL，重復性好，且不易受基質的影響。

RCA反應具有特異性強[25]、可檢測到特定信號以及高通量檢測的特點，但RCA反應易受到復雜基質條件的影響。再者，RCA擴增效率易受鎖式探針雜交以及探針與模板連接效率的影響。RCA反應在擴增時背景信號干擾問題嚴重，檢測效率低[26]。無論是指數擴增還是線性擴增，都要求模板為環狀，過程繁瑣，耗時費力[27]。

5 跨越式滾環等溫擴增技術

SRCA是由河北農業大學生物檢測技術創新團隊開發的一種新型體外核酸等溫擴增技術[28-29]。對于線性DNA的擴增，在BstDNA聚合酶作用下，添加若干個堿基合成單鏈DNA，從而跨過模板鏈兩端的“缺口”，形成非閉合環。繼而將先前合成的互補鏈置換下來，被置換下來的單鏈就像“卷尺”一樣不斷被拉長。同時，暴露出引物結合位點，引物與之結合并延伸，擴增產物為以靶序列和添加序列為單元的多個重復序列。SRCA技術目前已成功應用于食源性致病菌的檢測中。YANG等[30]利用該技術檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，靈敏度為7.8 fg/μL。張蘊哲等[31]將SYBR Green I熒光染料與SRCA技術相結合實現了對擴增結果的可視化鑒定。

該技術與RCA技術相比，無需鎖式探針和連接酶以及人為環化過程，操作步驟簡單，成本降低約3/4；與LAMP技術相比，所需引物數量減少，避免了引物之間的相互作用，成本降低約1/2，可通過測序驗證擴增結果的正確性。但SRCA技術也存在一定的不足，該技術需進行大量的預實驗篩選出1對特異性強的引物。此外，該技術在以往的研究中都是定性檢測，且主要是對單一目標菌株的研究。該技術目前應用范圍主要集中在食源性致病菌的檢測，針對摻假、轉基因、過敏原的檢測與鑒定尚在開發中。

6 等溫擴增技術的比較

本研究將上述5種等溫擴增技術進行對比，詳情見表1，相比于最先發展起來的PCR技術，等溫擴增技術擺脫了對昂貴且精密的溫度循環設備的依賴，更加適用于基層企業。對于核酸等溫擴增技術，引物的設計是關鍵，引物的特異性與數量都與擴增結果的準確性緊密相關。對于引物數量而言，SPIA技術僅需1條引物，最大可能的降低了引物自身的干擾問題；而LAMP反應引物數量多，易發生非特異擴增。對于反應溫度而言，SDA技術與RCA技術所需溫度不高，相比于其他技術更容易發生擴增反應，但也因此在試驗操作過程中，需嚴格控制環境溫度。對于反應時間而言，SRCA技術反應更加快速。對產物類型而言，LAMP技術、RCA(指數擴增)技術以及SRCA技術擴增產物均為雙鏈DNA，最為穩定，易于檢測，但也易造成交叉污染；SPIA技術、SDA技術及RCA(線性擴增)技術擴增產物則為單鏈DNA。

表1 五種等溫擴增技術的對比Table 1 Comparison of five isothermal amplification techniques

7 等溫擴增技術的共性問題及解決措施

等溫擴增技術的共性問題主要體現在以下幾個方面：(1)無法區分死活菌。等溫擴增的靶標為核酸，而無法判斷核酸的來源。(2)檢測病原菌種類有限。目前應用最多的是對1種或2種病原菌核酸的檢測，若要同時檢測多種病原菌則需加入多對引物，引物自身易相互反應而影響擴增的準確性。(3)前處理耗時費力。雜質的存在會造成堿基間氫鍵的損傷，影響引物與靶基因的結合，因此需經富集、提純等操作來降低蛋白質等雜質的干擾，步驟繁瑣，耗時長，還會導致信噪比降低。(4)易出現非特異性擴增。等溫擴增反應在短時間內大量擴增靶標的同時對于非靶標序列也進行了快速擴增。

隨著對等溫擴增技術研究的不斷深入與改進，針對以上問題也有了一些改進方法。疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)可選擇性的穿過死細胞的細胞膜與dsDNA發生不可逆的交聯反應，抑制后續擴增反應的進行，因此可區分死活菌[32-34]。LYU等[35]首次將PMAxx染料與qLAMP結合，用于食源性VBNC狀態病原體的檢測，為大量食品現場快速檢測提供了一種新方法。等溫擴增技術與微流控芯片技術相結合可實現核酸高通量快速檢測，操作簡單快速，成本低。李偉昊等[36]使用FTA濾膜直接對樣品進行處理，并制備模板DNA，無需進行繁瑣的前處理操作，縮短時間約12 h。針對氣溶膠污染問題，可在反應體系中加入羥基奈酚藍實現閉管檢測；一次性檢測裝置的開發與使用也大大降低了氣溶膠污染的影響；此外，還可向反應體系中加入液體石蠟以減少交叉污染[37]。針對假陽性問題，ZHANG等[38]開發了一種CRISPR/Cas12a系統可消除假陽性結果，此外，該研究中使用的尿嘧啶DNA糖基酶也可有效防止DNA擴增子的污染[39]，此方法較為新穎，在分子檢測中具有巨大的應用潛力。TIAN等[40]巧妙地將RCA和LAMP相結合，RCA產物可直接用于LAMP反應，僅需一種聚合酶，無需任何樣品轉移步驟，即可在一個步驟中同時進行RCA反應和LAMP反應，靈敏度得到顯著提高。針對產物分析中拖帶現象，可通過優化體系中各離子的濃度減少此現象的發生[41]。

8 小結

等溫擴增技術的研究范圍不僅僅局限于病原菌的檢測，還可應用于其他領域。LAMP技術還可應用于臨床病原微生物、DNA病毒、RNA病毒、真菌、胚胎性別鑒定以及轉基因等領域中；RCA技術還可應用于細胞原位檢測、單核苷酸多肽分析以及測序等方面；SPIA技術還可應用于基因表達分析、基因突變分析以及核酸測序等方面；SDA技術還可應用于丙型肝炎病毒及臨床疾病診治等領域中；SRCA技術還可應用于食品中轉基因、過敏原及摻偽成分的檢測等。等溫擴增技術的開發與應用彌補了傳統培養技術和PCR技術的不足。新的等溫擴增技術也在不斷崛起，我國自主研發的重組酶等溫擴增技術也逐漸發展起來，河北農業大學生物檢測技術創新團隊自主開發的SRCA技術目前也正處于多領域開發應用中。相信在今后的研究發展中，等溫擴增技術的檢測機制會變得更加智能化、節約化、便攜化。