桑葉和桑椹中的生育酚種類及含量檢測*

唐 露 羅太明 諶倫富 黃傳書

(重慶市蠶業科學技術研究院，重慶 400700)

生育酚又被稱作維生素E，是一類脂溶性強抗氧化劑的同類物質統稱，其根據甲基數目和位置的不同分為α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚4種形式。生育酚是生物體內一種十分重要的微量營養成分，人體缺乏生育酚會引起生殖系統萎縮和損害[1]。已有的研究表明，生育酚參與功能信號轉導、基因表達調控及抗低溫脅迫等多種代謝途徑，在提高動物和人體免疫力及應激能力、維持正常的生殖功能、清除細胞自由基、抑制不飽和脂肪酸酸敗，以及在發揮對植物光合器官的保護功能等方面都有十分重要的作用[1-3]。然而，具有重要生物學功能的生育酚卻只能在具有光合作用的植物中合成，人體和動物均不能在體內合成生育酚，只能通過食用植物性食品或提純的維生素E膠囊獲得[4]。近年來，天然維生素E每年的需求增長達10%，但中國的天然維生素E產品較少，市場幾乎被美國、德國、日本等國家壟斷。人工合成維生素E的生物活性與天然維生素E相差甚遠[5]，因此很有必要挖掘更多高維生素E含量的天然維生素植物源。

桑樹(MorusalbaL.)在中國有幾千年栽植歷史，有著豐富的種質資源，傳統栽桑主要用于養蠶繅絲。應用現代藥學與檢測技術的研究發現，桑樹的葉、果、枝、根中含有生物堿、黃酮、多糖、多酚、氨基酸及豐富的維生素等功能性活性物質，這些活性物質具有抗炎[6]、降血糖[7]、抗氧化[8]、降血脂[9]、降血壓[10]、清除自由基[11]等多種功效。桑樹在營養保健領域的開發利用價值已被逐漸重視，但目前對桑樹功能活性物質的研究主要集中在1-脫氧野尻霉素(DNJ)、黃酮類物質、花青素、多酚及多糖等幾大類，關于桑樹中生育酚的種類及含量研究則鮮有報道。鑒于此，本研究擬對桑葉和桑椹中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的含量進行系統測定和分析，以期為桑樹來源天然維生素E的開發利用提供試驗依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

于2020年5月4日上午9時(晴天)，在重慶市蠶業科學技術研究院桑樹資源圃分別隨機選擇“中桑5801”和“北桑1號”2個桑品種樹齡35年且長勢基本一致的桑樹各5株，每株從同側、中上段采摘完全成熟的桑葉和桑椹，并將各品種5株桑樹采摘的桑葉、桑椹分別混合后用去離子水沖洗，吸水紙吸干水分后，隨即放入裝有干冰的泡沫箱，帶回實驗室先放入-20 ℃、-40 ℃分別冷藏適應1 h，隨后保存至超低溫冰箱備用。

1.2 主要試劑和儀器設備

甲醇(色譜級，上海安譜)，超純水。α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標準品(Sigma)。

干式氮吹儀(無錫沃信儀器)，島津LC-20AT液相色譜儀(日本島津)，C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm，日本島津)，TLG-16低溫離心機(湖南湘儀)。

1.3 標準液配制

分別精密稱取α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標準品 1 mg，置于1 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制為質量濃度1 000 μg/mL的混標儲備液。將溶液轉移至棕色試劑瓶中，密封后在-20 ℃下避光保存6個月，作為對照。

1.4 標準曲線繪制

將配制的對照品儲備液用甲醇配制成含α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚分別為100 μg/mL的混合對照品溶液，取此溶液1 mL，用甲醇分別稀釋至2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL共6個質量濃度的標準品混合溶液，取各個濃度上述溶液進樣10 μL測定。以HPLC測得色譜峰面積(Y)與標準品濃度(X)進行線性回歸分析。

1.5 待測樣品液制備

將供試的桑葉、桑椹材料經高通量植物組織研磨器磨碎后，精確稱取0.2 g樣本，加入1%BHT乙醇溶液1 mL，混勻后加入100 g/L氫氧化鉀溶液1 mL，混勻于85 ℃恒溫提取40 min。冷卻后加入2 mL石油醚振蕩萃取10 min，取出醚相層，用超純水清洗3次后，氮吹至干，加入1 mL甲醇復溶，用針頭式過濾器過濾于帶有內襯管的樣品瓶內待測。

1.6 測定方法

1.6.1 液相條件

用島津LC-20AT高效液相色譜儀測定。C18色譜柱：250 mm×4.6 mm，5 μm。流動相：超純水(流動相B)與甲醇(流動相A)的體積比為10∶90。

1.6.2 梯度洗脫程序

開啟電腦、檢測器和泵，安裝色譜柱，然后打開軟件，在方法組中設置進樣量為10 μL，流速1 mL/min，柱溫20 ℃，設置梯度洗脫程序(表1)，走樣時間為35 min，檢測波長294 nm，設置完畢保存方法組。用流動相過柱子，待基線穩定后開始加樣。

表1 樣品中4種生育酚含量檢測的梯度洗脫條件

1.7 重復性試驗

精密稱取樣品6份，每份0.2 g，按方法“1.5”制備待測樣品溶液，分別進樣10 μL，記錄4種成分的峰面積。以峰面積為指標計算重復性。

1.8 穩定性試驗

精密稱取供試樣品0.2 g，按方法“1.5”制備待測樣品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h取樣10 μL測定色譜峰面積。

1.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品6份，每份0.2 g，分別加入對照品0.05 mg，用60%甲醇定容至刻度，按方法“1.4”平行制備，進樣10 μL，計算加樣回收率。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1 標準曲線及線性關系

配制的4種生育酚對照標液測定結果如圖1所示，4種生育酚標準品分別在20.84 min(α-生育酚)、24.20 min(β-生育酚)、25.15 min(γ-生育酚)、27.28 min(δ-生育酚)出現峰值。以峰面積為縱坐標(Y)，以生育酚質量濃度為橫坐標(X)計算得到各成分的校正曲線，具體如表2所示。從4種生育酚標準曲線分析看出，標液生育酚中4種有效成分的R2均>0.999[12]，表明其線性關系良好。

圖1 4種生育酚標準品的HPLC圖譜

表2 4種生育酚的標準曲線方程

2.1.2 儀器的精密度

用所配制的生育酚標準液對本試驗使用儀器的精密度進行測試。結果顯示，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的相對標準偏差(RSD)值分別為1.10%、1.12%、0.60%和0.89%，均<0.05[13]，表明本試驗測定儀器精密度良好，在可接受范圍內。

2.1.3 方法的重復性

重復性試驗結果顯示，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚RSD值分別為3.22%、4.77%、4.57%和2.67%，均<0.05[13]，表明該檢測方法重復性較好，在可接受范圍內。

2.1.4 樣品溶液的穩定性

分對0 h、4 h、8 h、12 h、24 h獲取的樣品溶液進行穩定性測試。結果顯示α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的RSD值分別為2.78%、4.38%、4.19%、3.44%，表明在0～24 h時間段內，供試樣品溶液性質穩定。

2.1.5 加樣回收率

供試樣品的加樣回收率測試結果表明，4種生育酚的平均回收率分別為94.77%、96.15%、97.37%、98.58%，其RSD值分別為1.82%、3.33%、2.98%、3.24%(表3)。

表3 4種生育酚的加樣回收率測試結果 回收率/%

2.2 桑葉和桑椹樣品中的4種生育酚含量

采用HPLC法對2個桑品種的桑葉和桑椹樣品中的生育酚成分及含量進行檢測的結果如表4、圖1所示，桑葉和桑椹中均含有4種生育酚。桑葉中含α-生育酚最多，中桑5801和北桑1號的占比分別為47.65%、62.49%；其次為δ-生育酚，2個品種的占比分別為33.3%、20.91%。桑椹中含γ-生育酚最多，2個品種的占比分別為44.67%、66.65%，其次為δ-生育酚，2個品種的占比分別為40.11%、28.73%，而生物活性最高的α-生育酚在桑椹中含量極低，2個品種的占比僅分別為5.13%和3.54%。總體而言，桑葉中總生育酚含量顯著高于桑椹，2個品種桑葉中的總生育酚含量分別為桑椹的3.88倍、2.35倍，2個品種桑葉中的α-生育酚含量分別是桑椹的36.12倍、41.46倍。

表4 2個供試桑品種桑葉和桑椹中的4種生育酚檢測結果 質量比/(μg·g-1，mf)

注：不同小寫字母表示同一部位不同成分生育酚差異顯著；**表示同一生育酚成分不同部位差異顯著。

3 討 論

本試驗采用HPLC法對“中桑5801”“北桑1號”2個桑品種桑葉和桑椹中的α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚進行檢測分析，結果表明：2個桑品種的桑葉和桑椹中均含有4種生育酚，桑葉和桑椹中4種生育酚含量差異顯著(P<0.05)；桑葉中的總生育酚含量顯著高于桑椹中的總生育酚含量，桑葉中的生育酚以α-生育酚為主，桑椹中的生育酚以γ-生育酚為主。

桑樹作為一種藥用植物資源，對其活性物質的深入研究具有重要意義。據已有的研究記載，生育酚在紫花苜蓿葉片中的平均質量比為31.81 μg/g[14]，而在萵苣葉中的質量比僅為0.2～0.8 μg/g[15]。本試驗檢測2個桑品種桑葉中的生育酚質量比均值為72.1 μg/g，顯著高于上述2種植物，且桑葉中表現生育酚主要生物活性的α-生育酚含量最高，表明桑葉可作為天然維生素E提取及利用的植物原料。本試驗為后續桑葉生育酚的提取純化，生物活性鑒定以及高生育酚含量桑樹品種的篩選奠定了良好基礎。然而，本試驗僅對2個桑品種的桑樹成熟葉片和桑椹進行了取樣測定，今后將對更多桑品種不同發育期的植株及不同器官部位中的各種生育酚含量進行檢測，并探究其變化。