基于譜效關聯分析的吳茱萸抗炎活性的質量標志物研究

惠 慧，陳祺松，田 港，單琪媛*，秦路平*

? Q-Marker研究 ?

基于譜效關聯分析的吳茱萸抗炎活性的質量標志物研究

惠 慧1，陳祺松2，田 港1，單琪媛1*，秦路平1*

1. 浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 311402 2. 寧波市鄞州區第二醫院，浙江 寧波 315192

采用譜效關聯分析方法探索吳茱萸抗炎活性的質量標志物（quality marker，Q-Marker），為其抗炎活性的質量控制提供依據。采用超高效液相色譜（UPLC）對24批吳茱萸藥材進行指紋圖譜分析；以脂多糖誘導小鼠單核巨噬細胞RAW264.7建立體外炎癥細胞模型，考察24批吳茱萸藥材對細胞上清液中一氧化氮（nitric oxide，NO）以及細胞內誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide-synthase，iNOS）水平的影響；采用SPSS軟件關聯指紋圖譜色譜峰峰面積與抗炎活性的關系，并采用UPLC-四級桿飛行時間質譜（QTOF-MS）對吳茱萸的抗炎活性成分進行指認。24批吳茱萸藥材對RAW264.7細胞上清液NO抑制率為12%～82%，譜效關聯分析共篩選出14個吳茱萸潛在抗炎成分，分別為吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿等吲哚喹唑啉類生物堿以及奎寧酸類成分、綠原酸類成分、喹諾酮類生物堿等。與模型組比較，檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、奎寧酸、去氫吳茱萸堿、二氫吳茱萸卡品堿、綠原酸、隱綠原酸可顯著抑制RAW264.7細胞上清液中NO水平及細胞內iNOS水平（＜0.05、0.01）。檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、奎寧酸、去氫吳茱萸堿、二氫吳茱萸卡品堿、綠原酸和隱綠原酸為吳茱萸抗炎活性的Q-Marker。

質量標志物；吳茱萸；超高效液相色譜；抗炎；譜效關聯分析；檸檬苦素；吳茱萸堿；吳茱萸次堿；奎寧酸；去氫吳茱萸堿；二氫吳茱萸卡品堿；綠原酸；隱綠原酸

吳茱萸作為一種傳統中藥，最早收錄于《神農本草經》，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉等功效，廣泛應用于臨床[1]。吳茱萸在我國分布較為廣泛[2]，然而由于其生長環境、采收時期、種植管理等因素差異，不同地區、批次藥材的化學成分和生物學特性也存在差異[3]。《中國藥典》2020年版僅規定了吳茱萸中檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的含量標準，對其藥效的質量評價參考較為局限。在中藥材來源、產地、種植條件多樣的特點下，如何科學、合理地評價中藥質量成為目前亟待解決的問題。基于現有質量評價與控制方法存在的問題，劉昌孝院士[4]提出中藥質量標志物（quality marker，Q-Marker）的新概念。Q-Marker策略目前已廣泛應用于中藥材的質量評價中[5-13]。陳洋等[14]運用Q-Marker方法發現吳茱萸止嘔效果與蘆丁、檸檬苦素、金絲桃苷、異鼠李素-3--蕓香糖苷、柯伊利素-7--蕓香糖苷、異鼠李素-3--β--半乳糖苷、1-甲基-2-正十一烷基-4-(1)-喹諾酮、1-甲基-2-[()-4-壬烯基]-4-(1)-喹諾酮有關；潘學強等[15]通過譜效相關分析發現吳茱萸湯偏頭痛療效與人參皂苷Rg1、吳茱萸苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿相關。Q-Marker為明確吳茱萸藥材及其復方藥效與成分間的內在關系以及制定科學的質量標準提供基礎。中藥具有多成分、多靶點的特點，其藥效往往是多種成分共同作用的結果，目前大多數中藥的藥效及毒性物質基礎尚不明確。中藥指紋圖譜能全面表征中藥的化學特征[16-18]，從整體上反饋藥材的質量。以中藥指紋圖譜為成分表征，結合細胞活性篩選，建立成分與藥效間的關聯，可以客觀、合理地反映藥材內在質量。

在機體的炎癥過程中，巨噬細胞被激活，產生炎癥反應，免疫細胞可釋放炎癥介質和促炎細胞因子，炎癥介質的過度表達可進一步加重炎癥反應，誘發關節炎、癡呆、心血管疾病、代謝性疾病、自身免疫性疾病、癌癥等多種慢性疾病[19]。現代藥理學研究表明，吳茱萸乙醇提取物能夠預防脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的內毒素血癥大鼠的循環衰竭、血管對苯腎上腺素的低反應性、肝功能障礙等癥狀，并抑制血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）的過量產生，且呈劑量相關性[20]。Woo等[21]發現吳茱萸中的主要活性成分吳茱萸次堿能夠抑制小鼠單核巨噬細胞RAW264.7中前列腺素的生成。課題組前期研究發現，吳茱萸醇提物對角叉菜膠致足腫脹、二甲苯致耳腫脹小鼠模型均有顯著的抗炎作用[22]。因此，本研究采用指紋圖譜結合細胞炎癥模型，篩選吳茱萸潛在的抗炎活性成分為Q-Marker，為藥效導向的質量控制提供依據。

1 材料

1.1 細胞

RAW264.7細胞購自中國科學院細胞庫。

1.2 藥材

分別于2017年、2018年、2019年從湖南、浙江、江西、貴州、廣西等地采集24批吳茱萸藥材（表1），經浙江中醫藥大學藥學院陳孔榮教授鑒定均為蕓香科植物吳茱萸(Juss.) Benth.的干燥近成熟果實。

1.3 藥品與試劑

檸檬苦素對照品（批號H23J9K65962，質量分數≥98%）、LPS購自上海源葉生物科技有限公司；對照品去氫吳茱萸堿（批號DSTDQ013601，質量分數≥98%）、吳茱萸堿（批號MUST-18031410，質量分數≥99.87%）、吳茱萸次堿（批號MUST-18031411，質量分數≥99.18%）購自成都曼斯特生物科技有限公司；色譜級甲醇、乙腈購自美國Tedia公司；分析級無水乙醇購自廣東光華科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司；細胞裂解液（批號031020200604）、蛋白酶抑制劑（批號101620201209）、BCA蛋白定量試劑盒（批號082820201207）、NO測定試劑盒（批號090420201111）購自上海碧云天生物科技有限公司；小鼠誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide-synthase，iNOS）ELISA試劑盒（批號202103）購自江蘇酶免實業有限公司。

表1 24批吳茱萸藥材中主要成分的質量分數

1.4 儀器

Acquity超高效液相色譜（UPLC）H-Class超高效液相色譜系統（美國Waters公司）；Milli-Q超純水處理系統（德國Merck公司）；KQ300DV型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；1510型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；半微量天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫：0～0.3 min，6.0% A；0.3～5.0 min，6.0%～8.0% A；5.0～8.0 min，8.0%～14.5% A；8.0～15.5 min，14.5%～22.0% A；15.5～18.5 min，22.0%～48.0% A；18.5～20.5 min，48.0% A；20.5～23.5 min，48.0%～70.0% A；23.5～25.5 min，70.0% A；25.5～27.5 min，70.0%～95.0% A；27.5～29.0 min，95.0% A；29.0～29.2 min，95.0%～6.0% A；29.2～31.0 min，6.0% A；體積流量為0.4 mL/min；進樣量為0.5 μL；自動進樣器溫度為20 ℃；柱溫為（30±5）℃；檢測波長為254 nm；檢測器為光電二極管陣列。

2.2 樣品溶液和對照品溶液的制備

2.2.1 樣品溶液的制備 將吳茱萸藥材打粉，精密稱定5.00 g吳茱萸粉末置100 mL錐形瓶中，加入50 mL 70%乙醇，混勻靜置1 h，超聲提取40 min，濾過，采用旋轉蒸發儀濃縮，于5 mL量瓶定容。取0.075 mL溶液，以70%乙腈稀釋至1.5 mL，經0.22 μm濾膜濾過后進樣，用于UPLC分析；取2.5 mL溶液采用旋轉蒸發器蒸干，用2.5 mL 50% DMSO溶解，于?20 ℃保存，用于細胞實驗。

2.2.2 對照品溶液的制備 去氫吳茱萸堿為吳茱萸中主要活性成分吳茱萸堿和吳茱萸次堿的結構類似物，具有良好的抗炎活性[23]，且在吳茱萸中質量分數較高，因此本研究增加去氫吳茱萸堿為待考察定量成分。分別稱取檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿對照品4.16、3.86、4.54、8.10 mg置10 mL量瓶中，用無水乙醇溶解并定容，得到對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線的制備 去氫吳茱萸堿、檸檬苦素和吳茱萸次堿的最大吸收波長為216 nm，吳茱萸次堿的最大吸收波長為225 nm。將對照品溶液梯度稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，以對照品質量濃度為橫坐標（），各成分色譜峰峰面積為縱坐標（），進行線性回歸，得到標準曲線方程。去氫吳茱萸堿回歸方程為＝5 195.50－10 414.00，線性范圍為810.00～1.58 μg/mL；檸檬苦素回歸方程為＝587.23－312.16，線性范圍為416.00～3.25 μg/mL；吳茱萸堿回歸方程為＝9 711.50＋2 003.30，線性范圍為386.00～0.37 μg/mL；吳茱萸次堿回歸方程為＝7 179.80＋6 056.30，線性范圍為454.00～3.55 μg/mL；所有回歸方程均≥0.999 0。

2.3.2 精密度試驗 取吳茱萸樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿色譜峰峰面積的RSD分別為0.98%、1.63%、0.49%、0.68%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 按“2.2.1”項下方法制備6份同一批次吳茱萸樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。各成分色譜峰峰面積的RSD均小于2.66%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 取吳茱萸樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件，于0、1、2、4、6、8、10、12、16、18、24 h進樣分析。各成分色譜峰峰面積的RSD均小于1.43%，表明樣品溶液在室溫下24 h內穩定。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱定2.50 g吳茱萸粉末6份，分別加入去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿對照品，按“2.2.1”項下方法制備吳茱萸樣品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。各成分加樣回收率為95.97%～104.65%，去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿色譜峰峰面積的RSD分別為0.99%、3.33%、0.80%、1.72%。

2.3.6 樣品中各成分的含量測定 取24批吳茱萸藥材，按“2.2.1”項下方法平行制備3份樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算吳茱萸中去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿的質量分數，見表1。

2.4 24批吳茱萸藥材指紋圖譜的建立與分析

將24批吳茱萸的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.130723版），以S13批次的吳茱萸藥材指紋圖譜為參照，采用中值法生成對照指紋圖譜，經多點校正和自動匹配后生成吳茱萸指紋圖譜見圖1。R相近、峰形相同的色譜峰被認為是具有指紋圖譜意義的共有峰，從圖1可以看出，有28個共有峰，占總峰面積的90%以上，不同批次的吳茱萸藥材中成分不同，各成分的質量分數也不同，可以用于譜效相關分析。其相似度分析結果見表2，各批次吳茱萸與對照指紋圖譜相似度為0.658～0.959，表明24批吳茱萸藥材存在一定差異。

圖1 24批吳茱萸藥材的UPLC指紋圖譜

表2 24批吳茱萸藥材指紋圖譜相似度分析

2.5 24批吳茱萸藥材體外抗炎活性的測定

2.5.1 細胞培養 RAW264.7細胞用含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，融合度達到70%～80%進行傳代。

2.5.2 細胞活力的測定 RAW264.7細胞以4×105/mL接種于96孔板中，100 μL/孔，培養6 h。設置對照組、模型組、地塞米松（5 μmol/L）組和吳茱萸（0.4 mg/mL）組，各給藥組加入相應藥物預處理2 h后，模型組及各給藥組再加入LPS（1 μg/mL），對照組加入不含藥物的培養基，培養40 h。棄去上清液，加入含10% CCK8的無血清DMEM培養基，于37 ℃孵育，采用酶標儀于450 nm處測定吸光度（）值。結果如圖2所示，42 h內85%以上批次吳茱萸藥材對RAW264.7細胞活力無明顯影響。

2.5.3 細胞上清液中NO水平的測定 按“2.5.2”項下方法處理細胞，按照試劑盒說明書測定細胞上清液中NO水平。結果如表3所示，不同批次的吳茱萸藥材的抗炎作用有較大差異，浙江、廣西產地的吳茱萸（S9～S15、S23、S24批次）抗炎作用較強，NO抑制率達60%以上，湖南邵陽產地的吳茱萸（S5批次）抗炎作用較弱，NO抑制率為12%，可能由于吳茱萸的采摘及儲存時間、果實成熟度和生長環境的不同，導致不同批次、地區的吳茱萸中化學成分發生變化，進而造成了各批次吳茱萸藥材抗炎活性的差異。因此，關于24批吳茱萸藥材的信息可以進行后續譜效相關性分析。

圖2 24批吳茱萸藥材對RAW264.7細胞活力的影響()

表3 24批吳茱萸藥材對RAW264.7細胞的NO抑制率()

2.6 譜效相關分析

Pearson相關系數是一種統計方法，可以定量地度量變量之間的相關性，廣泛應用于譜毒或譜效的相關分析。在譜效相關分析中，半數以上的指紋圖譜共有峰峰面積為自變量，NO抑制率為因變量，共篩選出20個Pearson相關系數大于0.40的色譜峰。采用UPLC-QTOF-MS技術對S3批次吳茱萸藥材提取液進行分析與成分指認，總離子流色譜圖見圖3，共鑒定并篩選出14個化學成分為潛在抗炎標志物見表4，進一步選擇能獲得對照品的化學成分（檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、奎寧酸、去氫吳茱萸堿、綠原酸、隱綠原酸、喹諾酮類生物堿等）進行體外抗炎活性驗證，因譜效相關分析篩選出的喹諾酮類生物堿大部分無法獲得，以同類型喹諾酮類生物堿二氫吳茱萸卡品堿為代表。

圖3 正離子(A)與負離子(B)模式下的UPLC-QTOF-MS總離子流色譜圖

表4 吳茱萸中的主要抗炎成分

“*”表示該化學成分有對照品

“*” means compound has a reference substance

2.7 吳茱萸潛在抗炎標志物的驗證

2.7.1 細胞上清液中NO水平的測定 根據預實驗，設置對照組、模型組、地塞米松（5 μmol/L）組、檸檬苦素（10、20、40 μmol/L）組、吳茱萸堿（1.25、2.50、5.00 μmol/L）組、吳茱萸次堿（20、40、80 μmol/L）組、奎寧酸（20、40、80 μmol/L）組、去氫吳茱萸堿（5、10、20 μmol/L）組、二氫吳茱萸卡品堿（5、10、20 μmol/L）組、綠原酸（0.25、0.50、1.00 mmol/L）組和隱綠原酸（0.25、0.50、1.00 mmol/L）組，按“2.5.2”項下方法處理細胞，按照試劑盒說明書測定細胞上清液中NO水平。結果如圖4所示，與模型組比較，檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、奎寧酸、去氫吳茱萸堿、二氫吳茱萸卡品堿、綠原酸、隱綠原酸均可顯著抑制細胞上清液中NO水平（＜0.05、0.01），呈劑量相關性。

2.7.2 細胞內iNOS水平的測定 RAW264.7細胞以8×105/mL接種于6孔板中，2 mL/孔，培養6 h。按“2.7.1”項下方法處理細胞，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，按照試劑盒說明書測定細胞內iNOS水平。結果如圖5所示，與模型組比較，檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、奎寧酸、去氫吳茱萸堿、二氫吳茱萸卡品堿、綠原酸、隱綠原酸均可顯著抑制細胞內iNOS水平（＜0.01），呈劑量相關性。

2.8 統計學分析

3 討論

本研究通過對吳茱萸藥材指紋圖譜和NO抑制率的譜效相關分析，確定24批吳茱萸藥材指紋圖譜中半數以上批次的共有峰與吳茱萸的抗炎活性有關，共挖掘出20個Pearson相關系數大于0.40的色譜峰；通過UPLC-QTOF-MS定性分析，共鑒定出14個化學成分，主要為檸檬苦素、奎寧酸類成分、綠原酸類成分、喹諾酮類生物堿等。NO由iNOS誘導催化產生，NO的累積會進一步加重炎癥反應的發生。通過對檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、奎寧酸、去氫吳茱萸堿、二氫吳茱萸卡品堿、綠原酸、隱綠原酸的抗炎活性驗證，發現以上8種化學成分均可顯著抑制細胞上清液中NO和細胞內iNOS水平，與文獻報道相符[13,23-26]。本研究基于譜效相關分析方法挖掘吳茱萸抗炎Q-Marker，發現除《中國藥典》2020年版規定的檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿外，去氫吳茱萸堿和二氫吳茱萸卡品堿也具有較好的體外抗炎作用。課題組前期在吳茱萸體內抗炎研究中發現吲哚類生物堿、喹諾酮類生物堿和檸檬苦素具有良好抗炎作用[22]，與文獻報道一致[27-28]。但本研究中抗炎指標較少，無法全面評價吳茱萸的抗炎作用，且對于含量差異小的成分不能通過譜效相關分析方法進行指認，因此，更多藥效方面的吳茱萸Q-Marker的確認仍需要更深入的研究。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下同

圖5 吳茱萸中不同成分對RAW264.7細胞內iNOS水平的影響()

綜上所述，本研究發現吳茱萸的抗炎作用來源于多種成分，并指認出檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、奎寧酸、去氫吳茱萸堿、二氫吳茱萸卡品堿、綠原酸、隱綠原酸為吳茱萸的抗炎Q-Marker，為中藥藥效結合成分的Q-Marker研究策略提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on anti-inflammatory quality markers ofbased on spectrum-efficacy correlation analysis

HUI Hui1, CHEN Qi-song2, TIAN Gang1, SHAN Qi-yuan1, QIN Lu-ping1

1. School of Medicine, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 311402, China 2. Ningbo Yinzhou No.2 Hospital, Ningbo 315192,China

To explore quality markers (Q-Marker) of anti-inflammatory activity of Wuzhuyu () by spectrum efficacy correlation analysis and provide basis for the quality control of anti-inflammatory effect of.Fingerprints of 24 batches ofwere analyzed by ultra performance liquid chromatography (UPLC). LPS was used to induce RAW264.7 cells to establish aninflammatory cell model, the effect of 24 batches ofon nitric oxide (NO) levels in supernatant and intracellular inducible nitric oxide-synthase (iNOS) level were detected; SPSS software was used to correlate the relationship between fingerprint chromatographic peak area and anti-inflammatory drug efficacy. UPLC-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (QTOF-MS) was used to identify anti-inflammatory active ingredients of.NO inhibition rate of 24 batches ofextracts was 12% — 82%. A total of 14 potential anti-inflammatory components ofwere screened out by spectrum-efficacy correlation, including indolequinazoline alkaloids such as evodiamine, rutaecarpine, dehydroaevodiamine, quinic acid, chlorogenic acid, and quinolone alkaloids. Compared with model group, limonin, evodiamine, rutaecarpine, quinic acid, dehydroaevodiamine, dihydroevodiacarpine, chlorogenic acid, and neochlorogenic acid significantly inhibited NO level in supernatant and iNOS level of RAW264.7 cells (< 0.05, 0.01).Limonin, evodiamine, rutaecarpine, quinic acid, dehydroaevodiamine, dihydroevodiacarpine, chlorogenic acid, and neochlorogenic acid may be anti-inflammatory Q-Marker of.

quality marker;(Juss.) Benth.; ultra performance liquid chromatography; anti-inflammatory; spectrum-efficacy correlation analysis; limonin; evodiamine; rutaecarpine; quinic acid; dehydroaevodiamine; dihydroevodiacarpine; chlorogenic acid; neochlorogenic acid

R285.5

A

0253 - 2670(2021)09 - 2589 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.09.010

2021-03-05

國家自然科學基金青年基金資助項目（81703707）；浙江省中醫藥科技計劃項目（2019ZA038）；寧波市鄞州區農業與社會發展科技項目（20191YZQ010017）

惠 慧（1995—），女，碩士研究生，研究方向為中藥資源與品質評價。E-mail: hhui@zcmu.edu.cn

單琪媛，女，實驗師。E-mail: shanqiyuan@zcmu.edu.cn

秦路平，男，博士生導師，教授。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]