靶向相變型載藥納米造影劑的制備及其基本性能和顯像特性檢測

劉建新 柳 陽 彭萬宏

超聲、CT、MRI、光聲成像等各種醫學影像技術在檢查敏感性、分辨率等方面各具優缺點［1］。目前各種醫學影像技術均有其各自的影像造影劑。盡管各種造影劑對疾病的診療發揮了一定的作用，但仍然不能突破單一影像技術的局限性。隨著現代醫學影像技術的不斷發展，尋求多模態多功能影像造影劑從而實現多種醫學影像技術的優勢互補，提高影像診療的精準度，已成為現代醫學的研究熱點［2］。本實驗以葉酸修飾的磷脂和膽固醇的混合物為成膜材料，將超順磁性氧化鐵（Fe3O4）納米顆粒和羥基喜樹堿（HCPT）裝載于殼層中，液態氟碳全氟戊烷（PFP）包裹于殼層內，制備葉酸靶向相變型載羥基喜樹堿的納米粒（FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs），并檢測其各種理化特性及其增強超聲、光聲、MRI 的顯影能力，為后續的實驗提供基礎。

材料與方法

一、實驗材料及儀器

1.主要試劑和細胞：氫化大豆卵磷脂、偶聯葉酸的磷脂、二棕櫚酰磷脂酰甘油（美國Avanti 公司），膽固醇［生工生物工程（上海）股份有限公司］，HCPT（遠大醫藥黃石飛云制藥有限公司），油酸氧化鐵納米顆粒（OA-Fe3O4，美國 Ocean Nano Tech 公司），PFP（美國Sigma 公司）；SKOV3 腫瘤細胞（重慶醫科大學超聲影像學研究所）

2.主要實驗儀器：RE-5298旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），VX130 聲振儀（美國Heat System 公司），5840R 低溫離心機（湖南凱達科學儀器有限公司），IX53 光學顯微鏡（上海賽默飛世爾科技有限公司），S-3400N 電子顯微鏡（日立公司），低強度聚焦超聲（LIFU）儀（重慶醫科大學超聲影像學研究所），MyLab 90 彩色多普勒超聲診斷儀（意大利百勝醫療集團），Achieva 3.0T磁共振儀（荷蘭Philips公司）。

二、納米粒的制備

將氫化大豆卵磷脂、偶聯葉酸的磷脂、二棕櫚酰磷脂酰甘油、膽固醇及HCPT 以一定的質量比（10∶4∶3∶3∶2）稱取后加入圓底燒瓶，同時加入OA-Fe3O4，用甲醇和三氯甲烷加熱溶解。約20 min 后將上述圓底燒瓶固定于旋轉蒸發儀上去除有機溶劑（時間120 min），然后加入PBS 洗脫水化，全程冰浴條件下逐滴加入液態氟碳PFP 200 μl，并使用聲振儀乳化，得到均勻的乳白色混懸液。應用低溫離心機在4℃條件下離心洗滌3 次，所得即為FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs，置于4℃冰箱保存備用。使用非偶聯葉酸的磷脂替代偶聯葉酸的磷脂即制備成非靶向納米粒，不加入OA-Fe3O4則制備成不含Fe3O4的納米粒。

三、納米粒基本性能檢測

1.基本性能檢測：在光學顯微鏡及電子顯微鏡下觀察納米粒的形態。于不同時間點（制備后6、12、18、24、30、36、42、48 h）分別取樣檢測FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs的粒徑。加入三氯甲烷和甲醇進行破球和溶解藥物，離心分離取上清液，使用反相高效液相色譜法檢測其內HCPT含量。

2.熱致相變研究：取制備好的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液稀釋100 倍后滴加于玻片上，并置于加熱板內，調節溫度分別為40℃、45℃、50℃和55℃，于光學顯微鏡下觀察納米粒的熱致相變情況并記錄。

四、體外尋靶實驗及分組

將富含葉酸受體的SKOV3 腫瘤細胞種植在共聚焦專用培養皿內，與紅色熒光染料DiI 標記的FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs（靶向組）和不帶葉酸的非靶向納米粒（非靶向組）共孵育40 min，然后用PBS沖洗，加入多聚甲醛固定腫瘤細胞。隨后依次加入熒光染料DiO 和DAPI，并避光送檢。拮抗組采用游離葉酸與培養皿內SKOV3 細胞共孵育，然后加入熒光標記的FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs，并依次進行固定、染色。于激光共聚焦顯微鏡下觀察各組染色情況。

五、體外多模態顯像增強實驗及分組

1.增強超聲成像：取2 ml FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液置入凝膠模型，使用LIFU 儀探頭對凝膠模型內乳液進行輻照。設置輻照參數：脈沖模式，輻照強度3.2 W/cm2，輻照時間1 min。然后取少許納米粒乳液于光學顯微鏡下觀察納米粒粒徑變化，了解其相變情況。最后使用彩色多普勒超聲診斷儀（探頭頻率12 MHz，機械指數0.06）對凝膠模型內納米粒乳液進行超聲顯像，使用灰階模式和造影模式觀察其在輻照前后超聲顯影情況，并應用重慶醫科大學DFY 軟件測量其聲強。

2.增強光聲成像：采用凝膠溶液稀釋制備的FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液，按最終混合液內Fe3O4濃度將其分為3組：0.5 mg/ml組、1.0 mg/ml組和2.0 mg/ml組，分別制作成凝膠塊并標記，以不加納米粒乳液的凝膠作為對照組，分別行光聲成像并記錄光聲值。光聲儀激光激發波長為680～950 nm，激發深度約1 cm。

3.增強MRI：取脫氣水作為對照組Ⅰ（Ⅰ），不含納米粒的1%凝膠作為對照組Ⅱ（Ⅱ）。將FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 乳液用1%凝膠稀釋成不同的濃度作為實驗組，記為：Ⅲ（5 μg/ml）、Ⅳ（10 μg/ml）、Ⅴ（20μg/ml）、Ⅵ（40μg/ml）、Ⅶ（80μg/ml）、Ⅷ（160μg/ml）、Ⅸ（320 μg/ml）、Ⅹ（640 μg/ml）、Ⅺ（1280 μg/ml）、Ⅻ（2560 μg/ml）。使用荷蘭Philips 公司磁共振儀，采用T2 加權系列，設置掃描參數：TR 30.2 ms，TE 9.2 ms，flip 45°，FOV 160 mm，slice thickness 3.0 mm。測量每組磁共振信號強度，測量3次取平均值。

結 果

一、納米粒基本性能檢測

不含Fe3O4的納米粒乳液外觀呈乳白色，含Fe3O4的納米粒乳液呈黑褐色（圖1A）。光學顯微鏡下制備好的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 呈球形，大小均一，分布均勻（圖1B）；激光共聚焦顯微鏡下納米粒呈球形或點狀（圖1C）。馬爾文儀測得納米粒平均粒徑約（321.20±67.21）nm，電位約-50 mV。透射電鏡顯示Fe3O4顆粒在納米粒內呈黑色小顆粒狀（圖1D），而不含Fe3O4顆粒的納米粒內未見黑色小顆粒（圖1E）。高效液相色譜法測得藥物包封率和載藥量分別為（60.51±2.33）%、（8.33±0.57）%。儲存在4℃冰箱內的納米粒在48 h 內呈現出良好的穩定性，其粒徑大小變化見圖1F。

二、納米粒熱致相變結果

在40℃時，無氣泡產生；45℃時鏡下可見氣泡，已發生相變；50℃時，可見大量氣泡產生；55℃時鏡下僅可見少許殘留大氣泡。見圖2。

三、體外尋靶實驗結果

在激光共聚焦顯微鏡下，經熒光染料DAPI 染色后的細胞核呈藍色熒光，經DiO 染色后的細胞膜呈綠色熒光，經DiI 染色后的納米粒呈紅色熒光。靶向組鏡下可見較多紅色熒光聚集在細胞膜周圍，而在非靶向組和拮抗組的細胞膜周圍未見明顯紅色熒光聚集。見圖3。

四、體外多模態顯像增強實驗結果

圖1 FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 基本性能檢測

圖2 不同溫度下納米粒的熱致相變光學顯微鏡圖

本實驗使用不同濃度的納米粒乳液進行體外光聲及MRI。①納米粒乳液經LIFU 輻照后，灰階超聲顯示其回聲增強，輻照前后聲強分別為（12.2±2.8）dB、（136.5±5.7）dB，超聲造影模式下顯示其高增強；輻照前后聲強分別為（6.7±2.3）dB、（86.3±5.2）dB；光鏡下可見輻照后納米粒體積增大，見圖4。②隨著濃度的增加，納米粒體外增強光聲成像的效果漸趨明顯（圖5），對照組、0.5 mg/ml組、1.0 mg/ml 組和 2.0 mg/ml 組所對應的光聲值分別為0.21±0.09、0.58±0.06、1.41±0.12、2.13±0.11。③隨著濃度的增加，納米粒體外負性增強MRI的效果越明顯，見圖6。

圖3 體外尋靶實驗的激光共聚焦顯微鏡圖

圖4 納米粒體外增強超聲成像圖

圖5 不同濃度組納米粒體外增強光聲成像圖

圖6 納米粒體外增強MRI圖

討 論

傳統的影像學檢查方式均有各自的優缺點［3］，融合多種成像模式的多功能造影劑的出現為現代分子影像學的發展指明了方向［4］，除顯像功能外，其還能夠在造影劑上裝載藥物，在影像監控下實現靶向治療。在這一思路引導下，本實驗擬制備集增強超聲、光聲、MRI及藥物控釋功能于一體的多模態多功能造影劑，并檢測其理化特性，驗證其增強多模態顯像效能。

Shin 等［5］研究結果發現，雖然液態氟碳 PFP 沸點僅29℃，但經磷脂包裹成為納米級顆粒后，由于納米粒周圍的Laplace 壓力明顯增加，PFP 的氣化閾值隨之升高。本實驗結果發現，在40°C 時納米粒基本不發生相變，當溫度逐漸升高至50°C 時，納米粒相變最顯著，鏡下見相變后產生大量氣泡，這說明PFP 納米粒既能保持一定的穩定性，也能在一定條件下繼發相變。同時本實驗也發現制備的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 在4℃條件下可穩定保存48 h 而不發生明顯相變。反相高效液相色譜法測得的HCPT 載藥量（8.33±0.57）%，包封率（60.51±2.33）%，較高的包封率和載藥量為后續的治療研究提供了保障。

本實驗使用的磷脂成分與生物有機體細胞膜的磷脂成分相同，安全性高；液態氟碳具備較好的攜氧能力，可被用作血液替代品［6］，同時其還能夠溶解于血液中并通過呼氣排出體外［7］；Fe3O4在體內可被紅細胞代謝，再進入正常血漿鐵池，參與到機體的代謝過程，具備良好的生物安全性［8］。葉酸性質穩定，分子量小，且無免疫原性［9］，較多惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌等組織中葉酸受體均呈高表達，而在正常組織中葉酸受體不表達［10］。在體外尋靶實驗中，靶向組在SKOV3腫瘤細胞周圍及內部見較多納米粒聚集，而非靶向組SKOV3 腫瘤細胞周圍及內部無納米粒聚集，說明葉酸具備的高效靶向性有連接其受體的能力；拮抗組在加入游離葉酸后，阻斷了后續加入的靶向納米粒與腫瘤細胞的特異性結合，也從側面說明了葉酸與腫瘤細胞結合的高效特異性。

體外多模態顯像增強實驗結果表明，FA-HCPTFe3O4-PFP NDs 可以明顯增強超聲、光聲及MRI 顯影能力。液態氟碳PFP具備良好的熱致相變及聲致相變的特性，超聲波被認為是最有效的繼發相變的方式，本研究中使用LIFU儀輻照制備的納米粒乳液，使得納米粒發生聲致相變，從而明顯增強超聲成像效果。引入Fe3O4后，納米粒具備增強光聲成像的作用，且隨著納米粒濃度的增加，光聲信號明顯增強，光聲值亦明顯升高。作為一種負性增強對比劑，Fe3O4使得納米粒的MRI T2 信號強度降低，且濃度越高其信號強度越低，與對照組的高信號呈明顯差異。

綜上所述，本實驗制備的FA-HCPT-Fe3O4-PFP NDs 同時裝載了PFP 和Fe3O4，有望實現多模態顯像；引入HCPT，使其在多模態顯像的同時，能夠達到藥物治療的目的；在納米粒表面修飾葉酸受體后，納米粒能夠特異性的靶向結合于高表達葉酸受體的腫瘤細胞周圍，進行局部精準顯像和靶向治療，使得FAHCPT-Fe3O4-PFP NDs有望成為極具潛力的分子探針。