當歸多糖對C57BL/6小鼠毛囊及毛發生長的影響

王月瑩 李嬋嬋 謝 君 姚小敏 宋繼權

武漢大學中南醫院皮膚科，武漢，430071

脫發在日常生活中極為多見，臨床可見的脫發性疾病類型也較多，包括脂溢性脫發、斑禿、藥物誘導的生長期脫發等[1]。近年來隨著生活工作壓力的增大以及人們對自身外表要求的提高，因脫發性疾病帶來的心理與精神壓力對人們的日常生活產生嚴重負面影響，對改善脫發的需求也日益增加,但臨床對于脫發的治療手段仍是有限的，且脫發性疾病的病理生理機制仍待探究。當歸是著名的中草藥之一，憑借其等廣泛的藥理活性在現代臨床心腦血管、抗腫瘤、血液系統疾病、消化系統疾病、婦科疾病等方面也得到了諸多的應用[2,3]。當歸多糖(angelica sinensis polysaccharide, ASP)作為當歸發揮藥理活性的主要成分之一，具有造血活性、抗氧化活性、免疫調節活性、抗菌消炎等作用[4]。目前當歸多糖雖廣泛應用于多個領域，但在脫發性疾病治療的方面的應用較為少見。本課題組既往研究已初步證實當歸多糖對體外毛囊生長具有促進作用。依據中醫治療脫發所主張的內服與外治法，通過建立脫發模型小鼠，采用灌胃與外涂的方法研究當歸多糖對促進小鼠毛囊及毛發生長的影響，以期為日后的臨床應用提供更多可行性依據。

1 材料與方法

1.1 動物 40只雌性7～8周齡的C57BL/6小鼠，由武漢大學動物實驗中心提供，許可證號SCXK(京)2016-0006。從中選擇毛發處于靜止期且皮色均勻粉紅無疤痕的小鼠參與實驗研究。

1.2 藥品試劑 當歸多糖粉劑，20 mg/瓶，由武漢欣申試化工科技有限公司提供，貨號：B25568。5%米諾地爾酊搽劑，由武漢大學中南醫院皮膚科提供；薇婷脫毛膏 (國妝特進字G20161330)，80 g/瓶，由武漢市武昌區密克斯實驗儀器經營部提供。

1.3 主要設備儀器 正置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯，型號：BX53)；全自動數字玻片掃描與分析系統(德國徠卡，型號：Aperio VERSA 8)。

1.4 方法

1.4.1 當歸多糖溶液的制備 20 mg/瓶當歸多糖粉劑，溶于無菌去離子水中配制成相應濃度的溶液，分別為125 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L,作為實驗中當歸多糖低、中、高劑量組實驗試劑，于4℃存儲備用。

1.4.2 脫發模型建立 用脫毛膏在小鼠背部固定部位脫毛，面積約為2 cm×3 cm。

1.4.3 分組 將脫毛后36只毛發處于靜止期的小鼠隨機分為9組，每組4只。(1)當歸多糖灌胃組，分別為：當歸多糖低、中、高劑量組，去離子水陰性對照組。(2)當歸多糖外涂組為：當歸多糖低、中、高劑量局部外涂組，米諾地爾酊陽性對照組，去離子水陰性對照組。

1.4.4 給藥 脫毛后第二天開始給藥；灌胃組、外涂組皆每日定時給藥一次，每次給藥量為0.2 mL，實驗過程中持續用藥21 d。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 觀察并記錄小鼠脫毛區皮膚顏色變化及所用時間 每日拍照記錄每只小鼠脫毛區皮膚顏色變化及從粉紅至灰色、從灰色至出現新生毛發的時間。

1.5.2 對新生毛發生長情況進行評分 參考文獻[5，6]脫毛后于第6、9、12 d對脫毛區新生毛發生長狀況進行評分，給定評分標準如下：皮膚呈粉紅色為0分，呈灰色為1 分，呈黑色為2分，呈黑色并有少許毛發長出為 3分；與其他部位無差別為4分。

1.5.3 HE染色 在用藥第4天，從各組中隨機選取一只小鼠進行皮膚環鉆活檢以獲取皮膚組織，以及在連續用藥21天后，使用脫毛膏脫去實驗區毛發，切取小鼠背部固定部位皮膚組織1塊，每塊長約1.0 cm，先后進行固定脫水、制作石蠟包塊、切片后進行HE染色(蘇木精-伊紅染色)等操作，于顯微鏡下觀察小鼠毛囊位置、數量及形態的變化。60倍顯微鏡下取5個視野，盡量選取不重疊區域，將5個單位視野內的毛囊計數取平均值。

1.6 統計學方法 將實驗記錄的結果輸入EXCEL建立數據庫,應用SPSS 22.0統計分析軟件對結果進行統計分析。計量資料結果統一以平均值±標準差表示，將連續性資料行正態性檢驗，如果服從正態分布，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間比較，如果組間差異有統計學意義，進一步采用LSD方法進行兩兩比較，否則采用Kruskal-Wallis H檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 當歸多糖對小鼠皮膚顏色變灰及毛發長出時間的影響，見表1、2，圖1。

分析結果發現，當歸多糖低、中劑量灌胃均可在一定程度是上加快小鼠皮膚顏色變化，使小鼠毛發從靜止期進入生長期的所需時間減少，兩組之間無統計學差異，且當歸多糖中劑量灌胃組可加快毛發長出(P<0.05)。當歸多糖外涂中、高劑量組與陽性對照組均可顯著縮短小鼠皮膚顏色變灰的時間，且外涂高劑量組可顯著加快小鼠毛發長出速度(P<0.05)。

2.2 于第6、9、12 d對小鼠背部脫毛區毛發生長狀況進行評分(圖2、3)。雖然組內差異比較未見明顯統計學差異，但從折線圖中可以清晰的看到低、中劑量灌胃組小鼠毛發生長評分明顯高于陰性對照組；除低劑量組外，其余外涂組小鼠毛發生長評分均顯著高于陰性對照組。

表1 灌胃組小鼠皮膚顏色變化的時間

表2 外涂組小鼠皮膚顏色變化的時間

注：圖中a、b、c、d所示分別為當歸多糖低、中、高劑量灌胃組與陰性對照組

表3 各組小鼠毛囊數量

4a：第4天對照組; 4b：第4天當歸多糖中劑量灌胃組; 4c:第21天對照組;4d:第21天當歸多糖中劑量灌胃組

2.3 毛囊數量 與灌胃對照組相比，當歸多糖低、中劑量灌胃組可促進脫毛區毛囊數目明顯增多，組間比較具有明顯差異(P<0.05)。與陰性外涂對照組相比，當歸多糖低、中、高劑量外涂組及米諾地爾陽性對照組均可促進脫毛區毛囊數目增多，差別具有統計學意義(P<0.05)。毛囊數量并不呈劑量依賴性，各組之間毛囊數量無明顯差異(P>0.05)。毛囊數量見表3。

2.4 當歸多糖對毛囊位置及形態的影響 見圖4。在用藥第4天，對照組毛囊數目仍較少，毛囊位置較為表淺，未見明顯黑色素產生；當歸多糖低、中劑量灌胃組可見明顯黑色素形成，毛囊數目明顯增多，毛乳頭膨大，深入皮下組織。在用藥21天后，灌胃對照組毛發呈棒狀，毛球部變細小，處于退行期；當歸多糖低、中劑量灌胃組毛囊仍可見較多黑色素，毛囊粗長，毛球膨大，多數仍處于生長期。

3 討論

既往研究表明，脫發患者的生活質量評分(DLQI)明顯高于正常人群，表明脫發患者的生活質量確實受到了疾病的影響，諸多患者也因此產生焦慮情緒，迫切需要控制或改善脫發狀況以幫助其恢復心理健康、提高生活質量[7]。目前臨床用于有關脫發治療方案有口服非那雄胺、局部外用米諾地爾酊，毛發移植、低能量激光治療及PRP局部注射等[8]，但當下治療方案仍多存在費用昂貴，所需時間較長，患者依從性差等問題。當歸多糖因其毒性低，藥理活性廣泛，目前在心腦血管疾病、抗腫瘤、血液系統疾病的治療等方面均已開展諸多研究[3]，但關于脫發治療的研究較為少見，是故我們通過本次實驗研究其對小鼠毛發生長的影響。本課題組既往研究已初步證實當歸多糖對人頭皮毛囊生長具有促進作用[9]，本次實驗再次證實了將當歸多糖對小鼠毛囊及毛發生長亦具有促進作用。

本次實驗選用C57BL/6小鼠作為脫發模型小鼠進行實驗研究，因該小鼠可通過對其皮膚顏色的觀察來推斷毛發的生長周期。C57BL/6小鼠皮膚中的黑色素細胞僅于生長期時合成黑色素，使皮膚呈現為黑色，至退行期皮膚慢慢變為灰色，靜止期時皮膚恢復至粉紅色[10]。我們通過對結果的分析可知，當歸多糖低、中劑量灌胃均可顯著縮短C57BL/6小鼠脫毛區毛發從靜止期進入生長期的時間，促進脫毛區毛囊數目增多，延長毛發生長期且中劑量具有促進小鼠毛發生長加快的作用(P<0.05)，而當歸多糖高劑量灌胃組與陰性對照組結果無統計學差異(P>0.05)；當歸多糖外涂組各實驗組均可促進脫毛區毛囊數目增多，中、高劑量組與陽性對照組也可以顯著縮短小鼠毛發從休止期進入生長期的時間(P<0.05)，高劑量組與低、中劑量組相比有統計學差異(P<0.05)，與陽性組對毛發生長的效果無明顯差異(P>0.05)。實驗的結果說明了適宜劑量當歸多糖對小鼠毛囊及毛發生長的積極作用。

本次實驗結果可能的原因如下：因小鼠皮膚表面有皮膚屏障，當歸多糖作為活血藥物，雖有一定的透皮作用，可越高濃度的當歸多糖作用于表面，皮內吸收可作用于毛囊微環境的當歸多糖濃度越高，從而呈現一定的濃度依賴性。中藥內服機制較為復雜，既往研究表明，當歸多糖可顯著提高大鼠脾淋巴細胞的轉化能力、NK細胞殺傷能力和血清IL-2含量，從而得出當歸多糖具有增強免疫功能的作用[11]。推測中劑量灌胃組的當歸多糖可導致最佳血藥濃度，從而促進毛發生長，高濃度口服可能導致了一定程度的免疫耐受。

我們探究當歸多糖治療臨床常見類型脫發的可能性。脫發性疾病在臨床上多見的有脂溢性脫發、斑禿、瘢痕性脫發等[1]。脂溢性脫發，又稱雄激素性脫發，目前認為可能造成脂溢性脫發的發病機制有毛發生長周期的變化、雄激素的影響、遺傳機制、有關分子機制及微炎癥機制等[8],轉化生長因子 (TGF)-β-Smad通路是調節毛囊生長周期的重要信號通路之一[12]。其中 TGF-β1 可能通過Smad3信號通路增加雄激素受體的轉錄活性[13],朱正新等的研究也表明當歸補血湯可以有效降低小鼠體內TGF-β1的表達[14]，抑制雄激素受體的轉錄活性從而可有效促進毛發生長。斑禿，俗稱“鬼剃頭”，是一種慢性自身免疫性炎癥性的疾病，雖然目前具體的發病機制仍待研究，但氧化應激在斑禿的發病過程中起到一定作用已經得到了許多研究的證實。 Bakry等[15]通過研究發現斑禿患者血清總氧化能力、丙二醛值明顯高于健康對照組，抗氧化能力顯著低于對照組，重度斑禿患者的氧化應激參數也顯著高于輕中度斑禿患者。一篇描述有關斑禿的系統回顧也顯示斑禿與氧化應激有關，與輕中度斑禿相比，重度斑禿的氧化參數水平顯著升高，研究發現抗氧化劑在斑禿治療中的使用可能是有益的[16]。臨床常見的瘢痕性脫發可分為原發性與繼發性兩大類。原發性瘢痕性脫發可根據其顯著的淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤模式將其分類，且由于疾病的罕見性，各種治療方法缺乏有效性證據，目前臨床治療的目的主要是停止或至少延遲脫發和瘢痕形成過程的進展，減少局部炎性癥狀以及減輕患者自覺癥狀[17]。繼發性瘢痕性脫發常見的情況是繼發于各種感染性疾病、燒傷、燙傷等，治療繼發性瘢痕性脫發的重要措施之一也是減輕局部炎癥反應[1]。其他類型的臨床脫發有生長期縮短所致的休止期脫發及放化療導致的生長期脫發等；目前多項研究已證實當歸多糖具有抗氧化、調節免疫和抗炎、抗輻射損傷的作用[18-21]，通過發揮此類作用，筆者認為當歸多糖在治療各種類型的脫發中具有廣闊的應用前景，但仍需對療效和機制進行更加深入研究。