非橋粒芯糖蛋白抗體在尋常型天皰瘡中的作用機制

謝志敏 沈旭成 戴向農 李青青 葉興東

1廣州市皮膚病防治所皮膚科，廣州，510095；2廣州醫科大學皮膚病研究所皮膚科，廣州，510095

尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris, PV)是一種慢性自身免疫性大皰性皮膚病。其發病機制為患者血循環中產生針對皮膚結構蛋白中的橋粒芯糖蛋白(desmoglein，Dsg)1和Dsg3的自身抗體，當自身抗體與抗原結合時，發生細胞連級反應，引起橋粒結構發生改變，導致細胞間黏附喪失和表皮內水皰形成。然而，通過直接或間接免疫熒光檢測到抗角質形成細胞(keratinocyte，KC)抗體的PV患者中，有10%～15%的患者抗Dsg1/3 ELISA檢測為陰性[1]。將抗Dsg1/3自身抗體檢測陰性的PV患者血清注射新生小鼠后也會出現棘層松解及水皰形成[2]。所以單憑Dsg1和Dsg3自身抗體不足以完全解釋天皰瘡中細胞間黏附喪失的機制。

在PV患者中，已經發現了許多針對橋粒其他結構和代謝蛋白的非Dsg自身抗體，如橋粒膠蛋白(desmocollin，Dsc)1和Dsc3、乙酰膽堿受體、線粒體蛋白、甲狀腺過氧化物酶、分泌途徑Ca2+/Mn2+-ATP酶亞型1(secretory pathway Ca2+/Mn2+-ATPase isoform 1，SPCA1)、斑菲素蛋白(plakophilin，PKP)1和PKP3、斑珠蛋白(plakoglobin，PG)及橋粒斑蛋白(desmoplakin，DP)等。研究表明，這些非Dsg自身抗體在天皰瘡發病的復雜過程中協同補充了抗Dsg自身抗體的經典作用。

本文旨在探討非Dsg蛋白在PV發病機制中的作用以及其在PV的檢測、靶向治療中的重要意義。

1 橋粒膠蛋白(desmocollin, Dsc)

Dsc屬于鈣黏蛋白家族，是橋粒的重要組成部分，在細胞間黏附中起重要作用。Dsc3主要表達于基底層與基底上層，Dsc2在表皮基底層的表達較低，Dsc1主要表達于表皮上層，后者已被證實是IgA天皰瘡的自身抗原[3]。抗Dsc3特異性抗體已被證實有致病性[4]，體外實驗發現抗Dsc3抗體會導致KC的黏附喪失[5]。抗Dsc抗體在副腫瘤性天皰瘡、皰疹樣天皰瘡和增殖型天皰瘡患者中可被檢出[6]。部分PV患者及非典型臨床表現的PV患者中也發現了抗Dsc1、Dsc2和Dsc3抗體[7,8]。Lotti等[9]發現，注射Dsc3自身反應性脾細胞的Rag2基因缺失小鼠的鼻和面頰周圍出現了紅斑、糜爛、結痂及斑片狀的毛發脫落。

近年來的研究表明，Dsg與Dsc之間的異質結合是橋粒連接的基本結構，Dsc和Dsg通過細胞最外層N末端的同質及異質性相互作用，介導相鄰細胞中間絲之間的連接[10]。Ishii等[10]通過體外實驗重組Dsg與Dsc的胞外域，發現抗Dsg抗體、PF-IgG及PV-IgG可以阻斷Dsg與Dsc的結合。

Mindorf等[11]對126例有口腔病變的PV患者進行Dsc1、Dsc2、Dsc3抗體檢測，僅有一例Dsg3陰性的患者檢測出抗Dsc3-IgG抗體陽性。因此有學者認為抗Dsc抗體并非適合PV患者的常規檢測，對于非典型臨床表現或抗Dsg1/3抗體檢測陰性的患者可以考慮進行抗Dsc抗體檢測。

2 斑菲素蛋白(plakophilin，PKP)

PKP是橋粒黏附至關重要的蛋白，參與調節橋粒內鈣黏蛋白的轉化和信號轉導，與其他橋粒間蛋白相互作用，促進橋粒鈣黏蛋白與DP和角蛋白中間絲網絡的連接。原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)顯示缺乏PKP1及PKP3的KC在細胞邊界處發現Dsg1和Dsg3的膜利用率和結合頻率下降，而PKP1是Dsg3聚集所必須的[12]。

PKP3參與了DP簇團向膜的轉移，并以Ras相關蛋白1(Ras-related protein 1,Rap1)依賴的方式穩定橋粒鈣黏蛋白[13]。Cirillo等[14]研究發現，PV-IgG與KC結合30 min后PKP3以Src依賴方式被酪氨酸磷酸化，隨后與Dsg3分離，最終部分被消耗，磷酸化的PKP3可能作為信號分子參與細胞的分離。PKP1的過表達可以增加橋粒長度，穩定并增強橋粒黏附，防止Dsg3和其他橋粒蛋白從細胞邊緣丟失，并可預防PV-IgG處理的KC連接體超微結構的改變[15]。

3 斑珠蛋白(plakoglobin，PG)、橋粒斑蛋白(desmoplakin，DP)

PG和DP是橋粒內的接合蛋白，它們作為跨膜黏附分子起到固定中間絲細胞骨架的作用。PV自身抗體導致PG的聚集及耗竭，PG的缺失導致細胞內聚力的喪失和p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的活化及角蛋白回縮，PG通過調控p38MAPK活性來調節細胞內聚[16]。

Thomas等[17]通過短干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)改變DP的水平發現，DP的耗竭與異常肌動球蛋白網絡連接和收縮力有關。DP在與PV-IgG共孵育后以蛋白酶C(protein kinase C，PKC)依賴的方式被磷酸化；而針對DP突變位點S2849G的綠色熒光蛋白載體的表達可阻止DP磷酸化，增強KC間黏附，改善自身抗體介導的角蛋白絲回縮，并增加PKC-α與活化C激酶1的PKC支架受體的聯系[18]。除此之外，DP還跟Rac、p38MAPK及Wnt/β-catenin 等信號通路相關[19，20]。

4 乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)

表皮KC同時表達煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)和毒蕈堿乙酰膽堿受體，這兩種受體亞型共同起作用以維持細胞與細胞間的粘附。乙酰膽堿主要位于表皮的最下層，起到調節KC增殖、遷移以及細胞與細胞、細胞與底物黏附的作用。有85%～100%的PV及PF患者產生抗角質形成細胞AChR抗體[21]。

PV患者血清的抗毒蕈堿乙酰膽堿受體M3亞型(muscarinic acetylcholine receptor subtype M3，M3AR)抗體水平比健康對照組升高[21]。Chernyavsky等[1]在抗Dsg1/3抗體陰性的PV患者中發現免疫球蛋白自身抗體與M3AR及SPCA1協同誘導棘層分解的機制。抗M3AR抗體增加了p38MAPK及非受體酪氨酸激酶Src的活性[2]。nAChR在細胞表面及線粒體外膜上表達。有研究表明，在線粒體外膜上，PV-IgG可以特異性地與幾種線粒體nAChR亞型結合，說明PV-IgG損害了這些受體的抗凋亡功能；而激活線粒體nAChR可以消除PV-IgG的促凋亡作用，減少細胞色素C(cytochrome c，Cyt C)釋放，且呈劑量依賴性，提示對線粒體的保護可能是煙堿類激動劑在天皰瘡中抗凋亡作用的新機制[22]。

多項研究發現抗Dsg3及抗AChR抗體與PV疾病嚴重程度顯著相關，抗M3AR抗體滴度隨著治療而下降，M3AR滴度或許可以起到病情監測的作用[21，23]。體外實驗發現毒蕈堿類及煙堿類拮抗劑增加KC的通透性，導致棘層松解，并擴大表皮細胞間隙；同時膽堿能激動劑能夠逆轉棘層松解[24]。提示膽堿能激動劑可能在天皰瘡的治療中起著重要作用。Chernyavsky等[2]發現單獨的抗M3AR、抗Dsc3及抗SPCA1自身抗體并不能導致小鼠水皰形成，只是在角質形成細胞上的黏附能力出現不同程度的改變；抗M3AR自身免疫性抗體加強了抗SPCA1自身免疫性抗體的促凋亡作用。提示非Dsg自身抗體同時攻擊不同的自身抗原，單獨或者協同誘導激活不同的下游信號通路參與疾病的發生。

5 分泌途徑Ca2+/Mn2+-ATP酶亞型1(secretory pathway Ca2+/Mn2+-ATPase isoform 1，SPCA1)

家族性良性慢性天皰瘡(Hailey-Hailey disease)的患者中發現ATP2C1發生了突變，Ca2+-依賴的細胞內信號和細胞內Ca2+/Mn2+穩態的改變，導致表皮細胞黏附喪失，表現為PV皮膚病變的非免疫表型[25]。而由ATP2C1基因編碼的SPCA1，已經在部分PV患者血清中發現[2]。體外實驗發現抗SPCA1自身免疫性抗體可導致KC明顯收縮[1]。抗SPCA1抗體增強細胞凋亡標記物細胞CytC跟半胱天冬酶(Caspase)9的活性，由抗SPCA1 抗體觸發的促凋亡信號傳導通路以線粒體為靶點[2]。

6 甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)

在天皰瘡患者及其親屬中發現自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease，AITD)的發病率最高，其次為類風濕性關節炎及1型糖尿病[26]，有學者認為PV跟AITD屬于同一類自身免疫性疾病群[27]。

研究發現4%～40%的PV患者抗甲狀腺過氧化物酶(thyroid peroxidase，TPO)抗體陽性，而抗Dsg1/3抗體陰性患者的陽性率更高[27,28]。缺乏PV相關人類抗白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)DQB1*0503的抗TPO抗體陽性率高于攜帶的患者，但疾病的嚴重程度與抗TPO抗體水平無關[27]。抗TPO抗體影響KC內的信號通路，類似于抗Dsg3抗體結合后的信號通路改變[27]。

7 線粒體蛋白(mitochondrial protein)

線粒體是細胞能量的主要來源，線粒體功能障礙會導致KC凋亡。研究發現PV-IgG激活KC中的線粒體凋亡通路，表現為CytC的升高和caspase 9的激活[29]。PV患者產生的抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibodies，AMAs)破壞了電子傳遞鏈，導致內膜的電化學梯度損失，增加了活性氧自由基的產生，降低了KC對應激的反應能力[30，31]。AMAs與抗Dsg抗體協同誘導表皮棘細胞松解，對AMAs的吸附抑制了PV-IgG在體內和體外引起的棘層松解[32]。對264例PV患者及138名對照組的蛋白組學分析提示88%的PV患者至少有一種線粒體蛋白抗體[30]。越來越多的證據表明，米諾環素、煙酰胺、環孢素等保護線粒體的藥物對PV患者有治療作用。對線粒體功能保護可能是一種非免疫抑制的新療法。

8 展望

總之，PV患者抗Dsc抗體、抗AChR抗體、抗SPAC1抗體、抗TPO抗體及抗線粒體抗體的滴度與患者病情密切相關，且治療成功后滴度降低，其中抗AchR抗體與PV患者的相關性更強，而抗Dsc抗體的特異性更高。另外部分抗Dsg抗體陰性的PV患者發現上述抗體陽性，對這些抗體的檢測是診斷不典型PV的一種方法。PV的常規治療中免疫抑制劑可以減少抗體產生，而非免疫抑制劑因其增加細胞黏附、減少細胞凋亡，是PV治療的新靶點。PKP、PG及DP等在穩定并增強橋粒黏附，固定中間絲細胞骨架等中有重要作用，線粒體蛋白有助于穩定KC細胞，通過促進PKP、PG及DP的表達以及保護線粒體功能可能是治療天皰瘡的潛在方法。