五味子乙素下調IGFBP2表達抑制吉非替尼耐藥肺癌細胞增殖

孫蕾，藍秀，呂祝慶，李偉文

溫州醫科大學附屬第五醫院 呼吸內科，浙江 麗水 323000

肺癌是世界范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康，其中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的惡性腫瘤，占肺癌的85%以上，大部分患者確診時已為晚期，治療效果不佳，5年生存率僅為17.1%[1]。吉非替尼（gefitinib，Gef）的應用顯著延長了患者無進展期和生存期，但極易耐藥[2]。五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是一種具有廣譜抗癌作用的中藥單體[3]，不僅能夠誘導腫瘤細胞凋亡、抑制細胞增殖[4]，還能抵抗多種抗腫瘤藥物（如多西他賽、阿霉素）的耐藥性[5-7]。然而，Sch B能夠緩解吉非替尼耐藥的作用及其機制仍未明確。胰島素樣生長因子結合蛋白2（insulin-like growth factor binding protein 2，IGFBP2）在肺癌組織中呈高表達，與腫瘤細胞的增殖、遷移、轉化等惡性生物行為密切相關[8]。也有研究報道IGFBP2與埃羅替尼、達沙替尼等藥耐藥有關[9]，IGFBP2 可能是緩解吉非替尼耐藥的關鍵靶點。因此，本研究觀察Sch B對Gef耐藥的PC9（PC9/GR）細胞增殖、凋亡的影響，并探討IGFBP2在Sch B抑制PC9/GR細胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 試劑 Sch B（＞98%，相對分子質量：400.4648， 貨號：S117968）購自美國阿拉丁公司，杜爾伯科改良伊格爾培養基（DMEM，貨號：11965118）、青霉素-鏈霉素雙抗（貨號：15140148）、胎牛血清（FBS，貨號：10091155）、胰蛋白酶（貨號：25300054）購自美國Gibco公司，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，貨號：M5655）、二甲亞砜（貨號：D2650）購自美國Sigma公司；IGFBP2（貨號：3922）、p-AKT（貨號：4060）、AKT（貨號：4685）、p-mTORC1（貨號：5536）、mTORC1（貨號：2587）和β-actin（貨號：4970）單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養與馴化 將人肺癌PC9細胞（ATCC細胞庫）培養種植于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM，取對數生長期細胞進行實驗。采用濃度遞增法構建Gef耐藥的細胞，使PC9能在含有200 nmol/L的Gef培養基中穩定存活，建立PC9獲得性耐藥細胞（PC9/GR）。

1.3 細胞轉染 按2×105個PC9/GR細胞接種于6孔培養板。用無雙抗、無血清培養基，置于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞融合至40%～50%時進行病毒感染。按照說明書方法，取 10 μL的IGFBP2 過表達腺病毒載體和陰性腺病毒載體原液，逐步濃度稀釋為10-7PFU/mL，按每孔 1 000 μL稀釋液加入細胞中，繼續培養8～12 h后觀察細胞狀態。在轉染后12、24、48 h觀察細胞轉染情況，獲得IGFBP2 過表達組和陰性載體組的 PC9/GR細胞，并用Western blot進行驗證。

1.4 細胞分組 將細胞分為PC9組、PC9/GR組，Sch B組、陰性載體組、IGFBP2過表達組、陰性載體+ Sch B組、IGFBP2過表達+Sch B組處理；Sch B組為用25、50、100 μmol/L Sch B處理的PC9/GR細胞，陰性載體組為陰性腺病毒載體轉染的PC9/GR細胞，IGFBP2過表達組為IGFBP2過表達腺病毒載體轉染的PC9/GR細胞，陰性載體組+Sch B組為陰性腺病毒載體轉染的PC9/GR細胞，并用50 μmol/L Sch B處理，IGFPB2過表達+Sch B組為IGFBP2過表達腺病毒載體轉染PC9/GR細胞，并用50 μmol/L Sch B處理，PC9/GR組為PC9/GR細胞，PC9組為未馴化耐藥的PC9細胞。

1.5 細胞存活實驗 將2×105個PC9/GR細胞接種于96孔板中，按PC9組、PC9/GR組，Sch B組、陰性載體+Sch B組、IGFBP2過表達+Sch B組處理，并繼續培養48 h后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃下孵育4 h。棄去上清液，加入二甲亞砜120 μL終止反應。酶標儀中檢測各孔的吸光度值，計算細胞存活率。

1.6 細胞凋亡檢測 將2×106個PC9/GR細胞接種于6 孔板中，按Sch B組、陰性載體+Sch B組、IGFBP2過表達+Sch B組處理，并繼續培養48 h后，收集細胞，加入1 mL PBS洗滌3次，再加入196 μL Binding buffer，并依次加入5 μL Annexin VFITC、10 μL PI，室溫下避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測。

1.7 Western blot檢測 用預冷PBS漂洗3次后，加入150 μL RIPA細胞裂解液，冰上裂解15 min，收集細胞裂解液，置于4 ℃離心機，12 000 r/min離心15 min，取上清液。取20 μg總蛋白用聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，轉至PVDF膜；經3%脫脂奶粉封閉1 h，加入適量比例的抗IGFBP2、p-AKT、AKT、p-mTORC1、mTORC1一抗，置于4 ℃冰箱過夜。用PBST緩沖液洗膜后，按1:10 000～1:20 000加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫下孵育2 h。洗膜后，用增強化學發光法顯影，Image J統計條帶的灰度值。

1.8 RT-PCR檢測 總RNA用TRIzol試劑（美國 Invitrogen公司）抽提，即加入1 mL TRIzol試劑吹下細胞，加入200 μL氯仿，EP管內靜置15 min后，置于4 ℃離心機，12 000 r/min離心15 min。取上清液，用1 mL 75%乙醇洗滌，再次離心，棄上清液、干燥后取RNA沉淀物。按照PrimeScript RT Master Mix（大連Takara公司）說明書合成cDNA。將反轉錄物用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒（大連Takara公司）在ABI 7500 PCR儀上進行real time-PCR擴增、檢測。使用GAPDH作為內參照，引物系列如下：IGFBP2上游5’-GCCCTCTGGAGCACCTCTACT-3’，下游5’-CATCTTGCACTGTTTGAGGTTGTAC-3’；GAPDH：上游5’-CT CCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3’，下游5’-CCCAATACGACCAA ATCCGTT-3’；采用ΔΔCt法分析IGFBP2 mRNA的表達量。

1.9 統計學處理方法 采用SPSS22.0統計軟件分析。計量資料以表示，2組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PC9與PC9/GR細胞存活和IGFBP2 表達差異 200 nmol/L的Gef處理條件下，PC9/GR組存活率無明顯下降，PC9組存活率顯著降低（見圖1A）；與PC9組比較，PC9/GR組IGFBP2的mRNA和蛋白表達明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖1B-D）。

2.2 Sch B對PC9/GR細胞增殖、凋亡的影響 與PC9/GR組相比，25、50、100 μmol/L Sch B處理的PC9/GR細胞存活率明顯下降（見圖2A），細胞凋亡比例明顯增加（見圖2B），差異有統計學意義（P＜0.05）；且吸光度值下降率約50%時，Sch B的濃度為50 μmol/L，該濃度用于后續實驗。

2.3 Sch B對PC9/GR細胞IGFBP2、AKT、mTORC1的影響 與PC9/GR組相比，25、50、100 μmol/L Sch B 處理的PC9/GR細胞IGFBP2、p-AKT、p-mTORC1明顯下降（見圖3），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 IGFBP2過表達減弱Sch B誘導的PC9/GR細胞增殖抑制作用 與陰性載體組相比，IGFBP2 過表達組IGFBP2、p-AKT、p-mTORC1明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與陰性載體+Sch B組相比，IGFBP2過表達+Sch B組細胞存活增加，細胞凋亡降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

圖1 PC9與PC9/GR細胞存活和IGFBP2表達情況

圖2 Sch B抑制PC9/GR細胞增殖促進凋亡

圖3 Sch B抑制PC9/GR細胞IGFBP2、AKT、mTORC1的表達

圖4 IGFBP2過表達對Sch B誘導PC9/GR細胞增殖抑制和凋亡作用的影響

Gef屬于第一代酪氨酸激酶抑制劑，靶向抑制EGFR分子生物學功能，顯著提高EGFR突變肺癌患者的臨床療效。然而，大部分患者接受Gef治療后極易發生耐藥，其機制包括：T790M突變、旁路信號通路、EGFR下游信號通路等[10]。胰島素樣生長受體1（IGF receptor 1，IGFR1）介導的信號通路被認為是EGFR受體抑制劑耐藥的關鍵通路。IGFR1通過激活PI3K/AKT信號通路，促使細胞逃避Gef的殺傷作用，且IGFR1受體抑制劑能顯著提高Gef的療效[11]。IGFBP2是胰島素樣生長因子結合蛋白家族主要成員之一，通過激活多條信號通路，如PI3K/AKT、ERKMAPK信號通路，參與肺癌細胞增殖、遷移、耐藥，介導腫瘤復發和轉移。研究表明IGFBP2通過增加腫瘤微血管新生來抵抗藥物的殺傷作用[12]。IGFBP2激活下游AKT信號通路，促使肺癌細胞對達沙替尼耐藥[8]。本研究結果也證實，與非耐藥細胞相比，Gef耐藥細胞內IGFBP2蛋白和mRNA表達量均明顯增加，說明了IGFBP2高表達可能是PC9細胞對Gef耐藥的關鍵分子。

Sch B是五味子的主要活性成分之一，具有化療增敏、緩解腫瘤耐藥的作用。YAN等[5]證實Sch B顯著增加多西他賽的抗腫瘤敏感性。HUANG等[6]證實Sch B能夠逆轉P-糖蛋白介導阿霉素耐藥作用。WANG等[7]證實Sch B抑制P-糖蛋白和促進蛋白酶體介導的survivin降解逆轉阿霉素耐藥性。本研究 中，Sch B處理后，PC9/GR細胞存活率明顯下降、細胞凋亡比例明顯升高，IGFBP2、AKT、mTORC1的磷酸化水平明顯下降，說明Sch B具有抑制Gef耐藥細胞增殖、下調IGFBP2、抑制AMT/mTORC1通路的作用。進一步研究發現，過表達IGFBP2 腺病毒顯著抵抗SchB對PC9/GR細胞增殖抑制作用。

綜上所述，本研究體外證實了獲得性Gef耐藥的PC9/GR細胞中IGFBP2表達增高，Sch B通過下調IGFBP2、抑制AKT/mTORC1，抑制PC9/GR細胞增殖。然而仍需在體內進一步研究Sch B對PC9/GR細胞耐藥的影響，為研發抗吉非替尼耐藥的新型藥物提供科學根據。