多功能復合納米材料Fe-Cur-KB靶向β淀粉樣蛋白：構建與體外MR成像

羅 靜，王培軍

(同濟大學附屬同濟醫院醫學影像科，上海 200065)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease， AD)隱匿發病、進行性發展，其病理主要改變為腦內β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein， Aβ)沉積形成的老年色素沉著(senile pigmentation， SP)和Tau蛋白過度磷酸化形成的神經細胞內神經原纖維纏結(neurofibrillary tangle， NFT)[1]。目前AD帶來的社會問題日趨嚴峻[2]，臨床迫切需要能夠早期診斷的檢查方法。多種成像探針現已問世[3-4]，其中基于Aβ的核醫學探針如11C-PiB、18F-Flutemetamol及18F-Florbetaben等已用于臨床，但因其存在電離輻射、半衰期較短及成本較高等問題，臨床推廣受限。本課題組前期成功構建的新型靶向Aβ的KB探針為18F-Florbetaben衍生物，通過保留18F-Florbetaben主體雙苯環結構并對其進行修飾，獲得了可透過血腦屏障(blood brain barrier， BBB)與Aβ結合且無電離輻射的新型探針。本研究擬構建結合KB探針、以聚乙二醇(polyethylene glycol， PEG)修飾的磁性四氧化三鐵及靶向藥物姜黃素(curcumin, Cur)的復合納米材料，通過體外實驗觀察其用于早期診斷AD的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與動物 KB探針[E-1-(4-(4-甲胺基-苯乙烯基-苯氧基)-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧雜庚酸-27-酸](寧波康貝生化有限公司)，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基-聚乙二醇 2000(distearoyl phosphatidylethanolamine-methoxy PEG 2000， DSPE-mPEG 2000)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-PEG-氨基(distearoyl phosphatidylethanolamine-PEG-NH2， DSPE-PEG-NH2)、Cur粉末、2-嗎啉乙磺酸[2-(4-Morpholino)ethanesulfonic acid， MES]、水溶性碳二亞胺[1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydroc， EDC](南京東納生物科技有限公司)，兔源抗Aβ抗體(4G8、6E10)(Covance)，堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG二抗(Sigma Aldrich)及馬-達二氏犬腎(Madin-Darby canine kidney， MDCK)細胞(中國科學院上海生命科學研究院)等。

無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級APP/PS1雄性轉基因小鼠10只，3月齡，體質量(25±5)g，購于南方模式生物科技股份有限公司，許可證編號：SCXK(滬)2017-0010，飼養于18～22℃、相對濕度60%～80%、12 h晝夜交替環境，自由采食、飲水。本研究通過院倫理委員會批準[倫理編號：2019-DW-(005)號]。

1.2 構建磁性納米材料

1.2.1 制備Fe-Cur納米顆粒 精確稱取30 mg DSPE-mPEG 2000 及10 mg DSPE-PEG-NH2固體粉末，加入2 ml氯仿超聲溶解；向上述溶液中加入3.5 mg Fe(以氯仿配制成濃度為7 mg/ml的溶液，500 μl)，超聲混勻后加入1 mg Cur粉末(以氯仿配制成濃度為2 mg/ml溶液，500 μl)，超聲混勻；移入茄形瓶中，加入3 ml去離子水，超聲混勻；將茄形瓶置入旋轉蒸發裝置，以70℃水浴旋轉蒸發至氯仿完全揮發；將茄形瓶置于磁鐵上，吸附不穩定產物；以針管吸取1 ml樣品，以0.22 μm濾膜過濾；最后以MES(15 mmol/L， pH 5.5)溶解。

1.2.2 制備KB修飾的Fe-Cur-KB納米材料 取KB分子(以二甲基亞砜配制成濃度50 mg/ml溶液，10 μl)加入990 μl MES(15 mmol/l，PH 5.5)中，超聲溶解，并取0.6 ml加入制備完成的Fe-Cur中，超聲分散，室溫孵育30 min；加入0.6 mg EDC(以MES配制成濃度10 mg/ml溶液，60 μl)，室溫避光過夜振蕩孵育；采用100 KD超濾管，以純水超濾2次，并濃縮至3 ml，使Fe濃度為1 mg/ml。

1.3 表征及穩定性測試 以X線透射電子顯微鏡觀察Fe-Cur-KB磁性納米材料的形態，Nano ZS90納米激光粒度分析儀檢測其水動力粒徑和Zeta電位；將Cur及KB分別稀釋為不同濃度(Cur：3、2、1、0.5 μg/ml；KB：33.33、6.67、3.33、1.33 μg/ml)溶液，利用紫外分光光度計測量其吸光度，繪制Cur及小分子KB的標準曲線，以10%乙腈溶液進行破乳、磁分離，之后收集上清測試載藥量。向規格為35 mm的細胞培養皿中加入2 ml含血清不完全最小必需培養基(minimum essential medium， MEM)/F-12，隨后依次加入10、50、100、200 μl Fe-Cur-KB原液，每個濃度重復2次，每日定時觀察培養皿底部有無沉淀，連續觀察7日。

1.4 細胞毒性實驗 在MEM+10%胎牛血清培養基中維持MDCK細胞，待貼壁融合達80%～90%時將細胞消化、離心，加入培養基，稀釋成濃度5×104/ml細胞懸液，混勻后加入96孔板，每孔100 μl；次日更換新的培養基，并依次加入10 μl濃度分別為0.90、0.50、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01 mg/ml的Fe-Cur-KB磁性納米材料，每個濃度設置3個復孔作為加藥組，另取3個復孔加入10 μl培養基作為未加藥組；于第3日更換新的培養基，并加入10 μl細胞計數試劑盒(cell counting kit-8， CCK-8)溶液，于培養箱中穩定30 min后，采用紫外分光光度計測量450 nm光密度(optical density, OD)，計算細胞存活率(%)=(OD加藥-OD空白)/(OD未加藥-OD空白)×100%。OD加藥為加入不同濃度材料的3個復孔OD均值；OD未加藥為第2日加入10 μl培養基的3個復孔OD均值；OD空白為未加入任何物質的空白3個復孔OD均值。

1.5 BBB模擬實驗 將MDCK細胞以每孔5×104個密度接種至12孔Transwell小室膜A室，每孔補液至500 μl；B室僅加入1 500 μl培養液，次日換液(圖1)。接種后每日記錄Transwell小室內細胞跨上皮電阻(transepithelial electrical resistance， TEER)，繪制電阻-時間曲線圖；待電阻穩定后棄去A、B室培養基，并用預先加熱至37℃的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗滌2次，每次平衡10 min后棄去PBS，最后向A室加入500 μl培養基及100 μl Fe-Cur-KB作為實驗組，并以600 μl培養基為對照組；B室均加入1 500 μl培養基，置于恒溫培養箱中培養24 h，收集100 μl加藥組和未加藥組B室液體，置于酶標儀下測量OD。

圖1 Transwell小室模擬BBB實驗示意圖

1.6 體外成像實驗 配置不同濃度(0.90、0.50、0.20、0.10、0.05、0.01 mg/ml)Fe-Cur-KB磁性納米材料溶液，以MFG-1000體外磁場發生儀檢測其成像情況。以Siemens Magnetom Verio 3.0T MR掃描儀、頭頸線圈采集圖像，參數：TR 600 ms，TE 15 ms，層厚2 mm，FOV 150 mm×150 mm。

1.7 靶向結合力實驗 飼養APP/PS1模型鼠至6月齡，心臟灌流后制作冠狀位腦切片，滴加兔源抗Aβ一抗(4G8、6E10)，孵育過夜；次日以堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG二抗孵育切片2 h，抗體稀釋比均為1∶50；于暗室中以紅色堿性磷酸酶底物工作液顯色30 min，雙蒸水清洗，以吸水紙吸干表面水漬，加入100 μl Fe-Cur-KB納米溶液孵育過夜；第3日行普魯士藍染色，梯度脫水并封片后于光鏡下觀察Aβ斑塊與納米顆粒的共定位。

1.8 統計學分析 采用SPSS 20.0統計分析軟件。以±s表示計量資料，行兩獨立樣本t檢驗，比較2組B室溶液OD值差異。以單因素方差分析比較不同處理組細胞存活率。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Fe-Cur-KB磁性納米材料 成功構建出Fe-Cur-KB磁性納米材料，合成示意圖見圖2。Fe-Cur-KB樣品的水動力粒徑和Zeta電位結果見表1。以溶劑蒸發法制備的磁性納米顆粒粒徑為26.93 nm，信號強、粒徑較為均一，聚合物分散性指數(polymer dispersity index， PDI)較小，分散性較好。Cur顆粒表面攜帶負電荷，Fe-Cur-KB的Zeta電位約-17.3 mV(圖3)。Cur及KB的標準曲線顯示Cur載藥量為0.3%，小分子KB載藥量為5.7%。材料在電鏡下呈約8～10 nm球形，形態均一，呈串珠狀排列(圖4)，且穩定性較好。

表1 Fe-Cur和Fe-Cur-KB顆粒水動力粒徑及Zeta電位

2.2 細胞毒性實驗 0.90、0.50、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01 mg/ml納米溶液孵育下MDCK細胞存活率分別為98.34%、101.98%、101.03%、102.44%、95.64%、106.74%、95.14%，單因素方差分析顯示組間細胞存活率差異無統計學意義(F=1.894，P>0.05)。

2.3 BBB模擬實驗 模擬BBB實驗第3日，TEER穩定>400 Ω/cm2，成功構建BBB模型(圖5)；第5日實驗組B室液體OD值(3.11±0.02)明顯高于對照組(2.84±0.12，t=4.028，P<0.05)，納米材料可成功通過BBB。

2.4 體外成像 不同濃度Fe-Cur-KB磁性納米材料在體外磁場發生儀下的T2WI信號呈階梯狀，成像效果優異(圖6)。

2.5 靶向結合力 通過一抗、二抗的特異性結合及攜帶紅色堿性磷酸酶的底物顯色液的顯色，Aβ斑塊呈紅色；Fe-Cur-KB磁性納米顆粒因攜帶鐵核心，普魯士藍染色后呈藍色。光鏡下可見紅色和藍色重疊，即Aβ斑塊與Fe-Cur-KB納米顆粒存在共定位，顆粒可特異性結合Aβ斑塊(圖7)。

圖2 Fe-Cur-KB磁性納米材料合成示意圖 A.KB探針分子式； B.Cur分子式； C.Fe-Cur-KB結構示意圖(紅色星為Cur，藍色圈為修飾分子KB，黃色圓為磷脂分子疏水端，黑色圓為四氧化三鐵核心顆粒)

圖3 Fe-Cur(A)和Fe-Cur-KB(B)的Zeta電位圖

圖4 透射電鏡圖示Fe-Cur-KB磁性納米粒子 A.4×105倍； B.5×105倍

圖5 TEER變化趨勢圖

圖6 不同濃度Fe-Cur-KB的體外MR成像

3 討論

目前AD發病機制仍未完全明確，現有遺傳學、病理學、細胞生物學證據均有力支持“Aβ中心理論”，即Aβ生成與清除障礙失衡所致Aβ沉積是AD發病的中心環節[5]。Aβ沉積引發其他因子參與完成AD臨床或病理改變，誘導細胞內微管相關蛋白Tau蛋白高度磷酸化而形成NFT，導致微管失去正常結構，神經元骨架瓦解，進而造成突觸神經元丟失[6-7]。

圖7 APP/PS1轉基因小鼠大腦切片免疫組織化學染色圖(×200) (紅色為Aβ斑塊；藍色為Fe-Cur-KB納米顆粒染色)

當前確診AD的方法僅有腦組織活檢或尸檢，以非侵入手段診斷AD則主要依賴各種量表評估認知，但常用簡明精神狀態量表及畫鐘測試等均存在語言偏倚或評分方法未能達成共識等問題[8]。以PET為代表的核醫學技術可利用特異性結合Aβ的探針進行成像，實現AD病理特征在體可視化，其關鍵在于探針上可特異性識別并結合病理標記物的功能基團。Aβ聚合物之間存在β折疊，具有高度共軛芳香環且結構較為平面的1,3-硫氮雜茚和1,2-二苯乙烯可插入其中，形成能夠特異性識別并結合Aβ的功能基團，即PET成像中顯示淀粉斑塊的核心結構[9]。但PET空間分辨率低，無法顯示<2 mm的斑塊，難以早期診斷AD。MR空間分辨率高于PET，且無電離輻射，是早期診斷AD的理想影像學手段之一。

傳統MR對比劑無靶向性及特異性，且無法通過BBB。AD帶來輕微BBB破壞，但滲漏的對比劑不足以引起MRI信號變化及顯示AD病理變化。本研究采用溶劑蒸發法將Cur負載在PEG和四氧化三鐵間的脂質環境下，使其穩定存在于復合材料中，依賴其表面羧基和PEG化四氧化三鐵顆粒上的氨基，KB小分子通過EDC實現化學耦聯，形成穩定的共價鍵(酰胺鍵)，由此成功構建出安全性較好的Fe-Cur-KB磁性納米材料；與傳統對比劑相比，其最大優勢在于具有通過BBB與Aβ靶向結合的能力，可在大腦中與Aβ特異性結合并形成信號差異，通過與周圍正常組織對比，即可實現早期診斷AD。

Cur提取自姜黃根莖，是天然黃色素，可抗感染、抗氧化、降低淀粉負荷并阻止Aβ聚集[10]。既往研究[11]顯示天然來源的Cur十分安全，即使攝入量達到4 g/d、持續半年，也未出現慢性不良反應。目前對于建立AD細胞模型方法存在較大爭議，通常采用單一因素誘導細胞，與AD發病機制的復雜性不符。此外，Cur能否提高AD模型鼠的學習記憶能力尚需通過行為學實驗進一步評估[12-13]。

總之，本研究構建的Fe-Cur-KB磁性納米材料在體外表現出良好的生物相容性和穩定性，具有透過BBB并與Aβ靶向結合及MR成像能力，有望用于MR早期診斷AD。