超聲引導下細針抽吸細胞學檢查聯合BRAF V600E基因檢測診斷甲狀腺影像報告和數據系統(TI-RADS)4類結節

胡加銀，陳 瀟，何 霖，陽建政，程 偉，杜 鵬，李 陶

(陸軍軍醫大學大坪醫院超聲科，重慶 400042)

甲狀腺結節在人群中的檢出率為20%～76%，其中惡性結節僅占5%～15%[1-3]，如何于甲狀腺結節中甄別甲狀腺癌[4]是臨床的工作重點。2015版美國甲狀腺協會(American Thyroid Association, ATA)指南[5]指出，細針抽吸細胞學檢查(fine-needle aspiration cytology, FNAC)是術前評估甲狀腺結節性質敏感性和特異性最高的方法，但由于細胞病理學診斷的局限性，仍對10%～40%結節難以確定其良惡性[1,6]，臨床處理相對困難。隨著分子檢測技術的迅速發展，近年二代基因測序作為輔助手段逐步用于術前檢測甲狀腺結節，與FNAC相結合，以提高術前診斷甲狀腺癌水平[7]。本研究觀察FNAC聯合BRAFV600E基因檢測術前診斷甲狀腺結節良惡性的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2018年10月—2019年7月陸軍軍醫大學大坪醫院152例甲狀腺結節患者，男39例，女113例，年齡24～65歲，中位年齡43歲。納入標準：常規二維超聲診斷甲狀腺結節，根據中國衛生健康委員會發布的《甲狀腺癌診療規范(2018版)》[8]，甲狀腺影像報告和數據系統(thyroid imaging reporting and data system, TI-RADS)分為4類；對多發結節患者選擇惡性程度最高者作為穿刺對象。排除標準：①血常規、心電圖及凝血功能嚴重異常；②無法配合穿刺手術；③2周內服用阿司匹林、氯吡格雷、雙嘧達莫等抗凝血藥物。檢查前患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 術前準備 于FNAC術前2周內完善血常規、心電圖、凝血功能檢查及術前傳染病4項聯合檢查，并對患者行集中宣教。

1.2.2 超聲引導下FNAC 采用Samsung RS80A彩色超聲診斷儀，L3-12A探頭，頻率3～12 MHz。以2%利多卡因行穿刺點局部麻醉,采用22G×5 cm穿刺針(八光)于超聲監視下刺入結節內部，之后退出針芯，反復提拉及旋切10次左右。每個結節常規穿刺3～4次、實時涂片3～5張，并迅速用無水乙醇固定后送細胞病理學檢查。

按照2007年美國國家癌癥研究所甲狀腺細胞病理學報告共識Bethesda系統[9]，病理細胞學結果分為6類：Ⅰ類，標本無法診斷或不滿意；Ⅱ類，良性結節；Ⅲ類，意義不明的細胞非典型性病變或意義不明確的濾泡性病變；Ⅳ類，濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤；Ⅴ類，可疑惡性腫瘤；Ⅵ類，惡性腫瘤。

1.2.3BRAFV600E基因突變檢測 迅速將穿刺內容物中的條形物挑入基因檢測液，采用北京泛生子基因公司專利“一步法”技術建庫，以Life測序平臺Intorrent/S5進行測序，將突變頻率>3%定義為突變陽性。

1.3 統計學分析 采取SPSS 22.0統計分析軟件。以χ2檢驗比較FNAC、BRAFV600E基因檢測及二者聯合的診斷效能。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

本研究152個結節中，TI-RADS 4a類結節占32.89%(50/152)，4b類占40.79%(62/152)，4c類占26.32%(40/152)；均接受高頻超聲、FNAC及BRAFV600E基因檢測,并經手術病理證實。

2.1 FNAC和病理結果 152個結節中，Ⅰ類6個(6/152，3.95%)，Ⅱ類8個(8/152，5.26%)，Ⅲ類18個(18/152，11.84%)，Ⅳ類2個(2/152，1.32%)，Ⅴ類44個(44/152，28.95%)，Ⅵ類74個(74/152，48.68%)；其中惡性結節133個，良性結節19個。

2.2 不同檢查方法診斷效能比較 以FNAC≥Ⅴ類為標準診斷惡性結節118個、良性34個；根據病理結果，診斷敏感度80.45%(107/133)，特異度42.11%(8/19), 準確率75.66%(115/152)。BRAFV600E基因檢測診斷惡性結節129個、良性23個，診斷敏感度93.98%(125/133)，特異度78.95%(15/19)，準確率92.11%(140/152)。FNAC聯合BRAFV600E基因檢測診斷惡性結節134個、良性18個，診斷敏感度98.50%(131/133)，特異度84.21%(16/19)，準確率96.71%(147/152)。BRAFV600E基因檢測及二者聯合預測甲狀腺結節良惡性均優于FNAC(P均<0.05)。

2.3 聯合基因檢測診斷FNAC不確定結節 26例(26/152，17.11%)術前FNAC難以確定甲狀腺結節性質。通過BRAFV600E基因檢測診斷基因突變21例(真陽性21例，假陽性0例)，無突變5例。術后病理證實21例為乳頭狀癌，1例濾泡癌，4例良性腫瘤，BRAFV600E基因檢測在FNAC不確定性結節中診斷的敏感度、特異度及準確度分別為95.45%(21/22)、100.00%(4/4)及96.15%(25/26)。見圖1。

3 討論

根據中國衛生健康委員會發布的《甲狀腺癌診療規范(2018版)》[8]分類標準，甲狀腺結節TI-RADS分類如下：0類，彌漫性病變；1類，正常甲狀腺；2類，囊性或實性為主，形態規則、邊界清楚的良性結節；3類，不典型良性結節；4類，可疑惡性結節，常出現以下惡性征象(分為4a、4b、4c 3個亞型)：實質性、低回聲或極低回聲、微鈣化、微分葉/邊界模糊、縱橫比>1，其中出現1種征象者歸為4a類，出現2種歸為4b類，出現3或4種歸為4c類；5類，超過4種惡性征象，尤其是有微鈣化和微分葉者；6類，經病理證實的惡性病變。

FNAC是臨床診斷甲狀腺結節的主要手段，但約10%～40%病例難以獲得可靠結果。尋找甲狀腺癌發生、發展的關鍵分子可為臨床診斷與制定合理的治療方案提供分子學依據。目前已經確定BRAF、RAS、TERT、TP53基因突變，RET/PTC、PAX8/PPARγ基因重排等與甲狀腺癌診斷和治療關系密切[10-12]。單獨或聯合檢測這些分子標記物有助于甲狀腺癌風險分層，是術前診斷的有效補充，并可為手術和術后治療提供指導[13-15]；但突變基因復雜多樣，且檢測價格貴，目前大多僅檢測少數幾種基因。BRAF基因突變是甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)最常見的分子標志物，其中98%為V600E突變[16]。既往研究[17]結果表明，根據BRAFV600E基因突變診斷PTC 的特異度達 99.8%；BRAFV600E突變聯合細胞學檢查能將FNAC的診斷敏感度從70%提高到85.3%，故可作為傳統FNAC的補充診斷方法[18]。本研究中單純FNAC診斷甲狀腺癌的敏感度為80.45%(107/133)，聯合BRAFV600E基因檢測后提高至98.50%(131/133)，明顯優于FNAC(P均<0.05)。

圖1 患者女，49歲，甲狀腺右側葉結節 A. 超聲聲像圖示甲狀腺囊實性結節(箭)； B.超聲造影中結節實性部分呈等增強，其余部分無增強； C.細針抽吸基因檢測發現BRAF V600E突變； D.術后病理診斷甲狀腺乳頭狀癌(HE，×100)

本研究中FNAC診斷甲狀腺癌的特異度較低(64/152，42.11%)，分析原因可能如下：①納入的甲狀腺結節均為TI-RADS 4類，其中4b和4c類占67.11%(102/152)，結節惡性風險較高；②均經術前FNAC聯合BRAFV600E基因突變檢測，手術治療基本針對突變陽性者，良性病變樣本量小。

本研究中FNAC未能準確診斷21個甲狀腺乳頭狀癌，分析原因：①14個結節最大徑0.33～0.90 cm，平均最大徑(0.54±0.03)cm，病理均為微小乳頭狀癌，穿刺時難于精確定位，且可供活檢的細胞量不足；②3個結節內部及邊緣可見粗大鈣化，導致穿刺時細針進入結節內部困難，抽吸活檢獲取的有效細胞量少；③2個為囊實性結節，以囊性為主，實性部分較少，導致有效細胞量不足。實際臨床工作中，穿刺液中的條形物會影響涂片質量，通常予以丟棄，但其中的條形組織樣本含有大量DNA，足以進行突變測試。本研究針對這部分條形物進行基因檢測，實現了較高診斷效能。

本研究Bethesda系統共診斷18例意義不明確的細胞非典型病變(Ⅲ類)，術后證實15例為PTC，包括9例微小乳頭狀癌，其中14例術前基因檢測發現BRAFV600E基因突變，使術前診斷更為準確。

本研究不足之處：①樣本量較小，可能存在選擇性偏倚；②觀察項目較少，未分析結節大小、手術方式及頸部淋巴結轉移情況等。

綜上所述，FNAC聯合BRAFV600E基因檢測預測甲狀腺結節良惡性優于單純FNAC，有助于術前進一步評估FNAC診斷不明確結節的惡性風險。