文蛤轉錄組中微衛星位點生物信息分析

田 鎮，陳愛華，吳楊平，陳素華，張 雨，曹 奕，張志東，李秋潔

（1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海201306；2.江蘇省海洋水產研究所，南通 226007）

文蛤（Meretrix meretrix）隸屬簾蛤目（Veneroida），簾蛤科（Veneridae），是一種廣溫、廣鹽性灘涂埋棲型經濟貝類，為我國主要養殖貝類和出口水產品之一［1］。近年來，有關文蛤生物學特性以及基因資源挖掘等多方面研究越來越多，極大地促進了文蛤養殖業持續健康發展［2］。目前，關于文蛤生理脅迫［3-5］、呼吸代謝［6］、過氧化氫酶分析［7］、遺傳多樣性［8-9］等方面的研究已有眾多報道，但在轉錄組水平SSR微衛星特征生物信息學分析方面的研究鮮有報道。

微衛星（microsatellites），也稱簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR），為1～6個核苷酸組成的短串聯重復序列［10］，具有高穩定性、特異性和共顯性等優點，多應用于水產生物遺傳多樣性分析和分子標記育種等領域［11］。隨著高通量測序技術發展，通過轉錄組、基因組等測序平臺大量快速測定DNA分子序列技術，利用生物信息學分析開發出數量龐大的SSR標記，已在多種水產動物中得到廣泛應用［12］。

本研究采用第二代高通量測序技術對文蛤進行轉錄測序（RNA-sequencing，RNA-Seq），通過對文蛤轉錄組中不同類型微衛星的統計與分析，了解其微衛星分布頻率和數量，從轉錄組水平闡明文蛤SSR組成特征，對進一步利用微衛星標記技術開展遺傳標記輔助育種和種群遺傳學研究具有重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 動物材料

實驗用文蛤于2017年3月取自江蘇省文蛤良種場（南通），隨機挑選外形完整、無損傷的廣西和江蘇原種個體各30粒。取其鰓、肝胰腺組織樣品浸沒在RNAlater溶液（天根，中國）中，并于-80℃儲存。

1.2 數據來源

提取文蛤鰓、肝胰臟組織樣本的總RNA，送生工生物工程（上海）股份有限公司采用PacBio SMRT測序技術和Illumina RNA-Seq技術進行轉錄組測序，通過整合PacBio SMRT和Illumina測序數據，生成高質量的文蛤轉錄組數據，以此作為分析數據。

1.3 SSR位點搜索

用Krait10.2軟件［13］對文蛤轉錄組中的SSR位點進行搜索和統計。搜索參數為：單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸，最少重復次數分別為12、7、5、4、4、4。SSR分布的平均距離＝總Unigene長度／搜索到的SSR數量，出現頻率＝搜索到的SSR數量／總Unigene數量［14］。用Perl語言操作系統下MISA軟件進行檢驗。

2 結果與分析

2.1 文蛤轉錄組中SSR的數量

文蛤的轉錄組中共檢索到98 598條編碼序列（coding sequence，CDS），總長110 964 842 bp，GC含量約為36.17%。通過對文蛤進行SSR位點搜索，共發現完整的SSR位點8 856個，SSR總長度為162 416 bp，平均長度18.34 bp，約占總序列長度的0.15%。SSR詳細信息見表1。

2.2 微衛星序列的重復堿基類型分析

文蛤SSR位點堿基重復數量統計見表2。單堿基重復序列在文蛤轉錄組中所占比例最高（33.89%），其次為三、四堿基重復序列占比（分別為25.45%、24.84%），二、五堿基重復序列占比再次之（分別為11.88%、3.79%），六堿基重復序列占比最低（0.15%）。每種重復堿基類型的分布密度情況為：四堿基＞三堿基＞單堿基＞二堿基＞五堿基＞六堿基；SSR發生頻率大小依次為：單堿基＞三堿基＞四堿基＞二堿基＞五堿基＞六堿基。

表1 文蛤轉錄組中SSR位點搜索結果Tab.1 Search results of SSR in RNA-sequencing of Meretrix meretrix

表2 文蛤微衛星SSR位點類型Tab.2 SSR types of Meretrix meretrix

本次檢索的8 856個SSR位點中共包含26種重復堿基元（表3）。單、二、三、四、五、六堿基重復分別有2、4、5、5、5、5種。在單堿基重復中，A／T重復基元所占比例最大（31.72%）；二堿基重復基元（AT／TA）、三堿基重復基元（AAC／TTG）和四堿基重復基元（AAAC／TTTG）占比相近（分別為6.33%、10.24%、6.64%）；五堿基重復基元（AAAAC／TTTTG）和六堿基重復基元（AATACC／TTATGG和AATCCC／TTAGGG）占比最少（分別為0.25%、0.02%、0.02%）。這表明在文蛤轉錄組中微衛星位點的分布對A／T具有偏好性。

2.3 微衛星序列數量及長度分布

SSR重復類型的重復數存在較大差異（圖1）。SSR位點數量隨著重復次數的增加而呈明顯減少的趨勢，四堿基、五堿基、六堿基重復隨著重復次數超過4、4、5次時數量呈平滑曲線減少；單堿基重復、二堿基重復和三堿基重復隨著重復次數增加到11、6、4次后，SSR位點數量開始呈線性升高，重復次數超過5、7、12次，平緩下降，直至為0。二堿基重復、三堿基重復、四堿基重復、五堿基重復和六堿基重復的重復次數大多分布在4～11，僅單堿基重復的重復次數為11～19。

文蛤轉錄組中所發現的8 856個完整型微衛星位點中，微衛星的長度差異不大，片段長度范圍為10～35 bp，平均長度18.34 bp（圖2）。其單堿基、三堿基、四堿基重復片段長度分別為12 bp、15 bp、16 bp時SSR位點數量最高（分別為1 219條、1 193條、1 225條）約占完整微衛星總數的41%。除單堿基重復隨著重復片段長度的增加，位點數量呈平滑曲線下降。其他堿基重復分布特點呈“波浪形”分布并逐漸下降。

表3 文蛤轉錄組SSR中優勢重復堿基組成和頻率統計Tab.3 Composition and frequency of dom inant repeatmotifs in the RNA-sequencing of Meretrix meretrix（in consideration of sequence com plementarity）

圖1 文蛤轉錄組中每種類型SSR數量隨重復次數分布Fig.1 Variation of repeat times w ith the number ofm icrosatellites in the RNA-sequencing of Meretrix meretrix

圖2 文蛤轉錄組中微衛星的長度分布Fig.2 Length distribution ofm icrosatellites in the RNA-sequencing of Meretrix meretrix

3 討論

本研究共獲得8 856個完整性SSR位點，SSR的發生頻率為8.98%，平均分布長度為18.34 bp。文蛤SSR發生頻率與櫛江珧（Atrina pectinata）（8.2%）［15］、墨西哥灣扇貝（Argopecteni rradiansconcentricus）（10%）［16］、縊蟶（Sinonovaculaconstricta）（8.89%）［17］相似，但比泥蚶（Tegillarcagranosa）（14.83%）［18］、馬氏珠母貝（Pinctadamartensii）（13.34%）［19］略低，說明文蛤SSR位點分布豐度處于較低的水平。這也可能與數據庫的大小、SSR位點的搜索標準以及物種間的分布特征有關［20］。

基于轉錄組水平搜索的文蛤微衛星重復類型中，單堿基重復類型的占比最高為33.89%，其次為三堿基、四堿基重復類型（分別占25.49%、24.84%），這與通過EST-SSR方法開發出的文蛤［21］、馬 氏 珠 母 貝［19］、菲 律 賓 蛤 仔（Ruditapes philippinarum）［22］、羅 氏 沼 蝦（Macrobrachium rosenbergii）［23］、斑鱧（Channamaculata）［24］和扁玉螺（Neveritadidyma）［25］SSR位點中呈現出單堿基重復數量最多，二堿基重復、三堿基重復和四堿基重復數量依次遞減的趨勢相似；但與櫛孔扇貝（Chlamysfarreri）［26］、三 角 帆 蚌（Hyriopsis cumingii）［27］、黑鯛（Acanthopagrusschlegelii）和真鯛（Pagrusmajor）［28］SSR三堿基重復類型數量最多有所不同。不同物種間的堿基重復類型不同，研究認為高等水生動物以低重復基元居多，而低等水生動物以高重復基元居多，但文蛤作為低等貝類動物以單堿基重復和三、四堿基重復類型的比例高，可能暗示該科貝類具有更高的進化水平、更長的進化時間或更高的突變頻率［14］。目前大部分的SSR標記采用的是二堿基重復SSR，擴增出的產物常會出現影子帶，對于結果分析存在一定的干擾性。而四堿基重復SSR相比二堿基重復SSR標記不但多態性更高，而且遺傳穩定性更好［29-30］。根據文蛤SSR特征，可以嘗試開發三堿基、四堿基重復的SSR標記，為今后開展文蛤等貝類種群遺傳多樣性分析等研究提供新的思路。

通過單堿基、三堿基和四堿基3種重復類型中各重復單元比較發現，在各重復長度中，A／T較G／C含量高出很多，這與很多水產生物基因組SSR具有的特點相一致，如金烏賊（Sepia esculenta）［31］、中 國 明 對 蝦（Fenneropenaeus chinensis）［32］、三 疣 梭 子 蟹（Portunustri tuberculatus）［33］SSR。水生生物中微衛星富含A／T的原因可能是由于DNA復制滑動機制和重組機制，導致A／T重復類型的機率更高［34］。也有研究認為，由于基因組DNA中的CpG的甲基化使之突變，甲基化的胞苷酸C易通過脫氨基作用變為胸腺嘧啶T，而少量的GC又是維持DNA熱力學穩定性所必需的，故突變的A／T類型相應增加［35］。

SSR分子標記多態性的高低決定其潛在利用價值，其多態性取決于其SSR片段長度大小［36］：當長度小于12 bp時，呈低多態性；片段長度為12～20 bp時，呈中度多態性；長度大于20 bp時，呈高多態性［37］。從SSR片段長度來看，本次基于轉錄組開發的文蛤微衛星中71.22%的長度處于12～20 bp之間，屬于中度多樣性。這對后續微衛星分子標記開發有一定的利用價值。

4 小結

本研究利用生物信息學軟件分析比較了文蛤轉錄組中微衛星序列的分布特征，結果顯示：文蛤具有以單堿基為主、三四堿基重復次之的微衛星序列；文蛤轉錄組SSR共包含26種重復基元，其中優勢基元為單堿基重復A／T有2 809個，其次為三堿基重復AAC／TTG有907個，四堿基和二堿基重復中的AAAC／TTTG、AT／TA分別有588、561個，說明文蛤轉錄組微衛星位點的分布對A／T具有偏好性。本研究結果將為研究文蛤SSR標記開發、群體遺傳多樣性、遺傳連鎖圖譜、種質資源鑒定和分子遺傳育種等后續研究提供基礎數據。