中國鱟消化道發育組織學觀察

鮑虞園，葉國玲，李銀康，謝木嬌，藍軍南，頡曉勇

（1.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室，廣州 510300；2.上海海洋大學，水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海水產養殖工程技術研究中心，上海 201306）

中國鱟（Tachypleustridentatus），隸屬于肢口綱（Merostomata），劍 尾 目（Xiphosura），鱟 科（Limulidae），東方鱟屬，因頭胸部具有發達的馬蹄形背甲，故又被稱為馬蹄蟹。鱟主要生活在淺海沙質海底，喜棲息于鹽度較低的河口，同時具有溯河而上的習性［1］。其主要分布于中國東南沿海、日本以及東南亞等地［2］。鱟為典型的雜食性動物，其自然餌料涵蓋面極廣且混雜，尤其喜愛攝食海洋浮游植物、微藻類及底棲無脊椎動物［3-4］。鱟在醫藥、科研、民俗文化及沿海生態保護等方面為人類提供了極為重要的利用價值，但隨著經濟的快速發展，鱟的棲息地環境遭受污染、破壞甚至消失，使其種群資源大量衰退，中國鱟更是岌岌可危［5］。中國大陸已將鱟列入“名貴珍稀水生動物”，中國香港也將其列入保護項目［6］，2019年3月，世界自然保護聯盟（IUCN）正式將中國鱟在IUCN紅色名錄中的等級從原本的數據缺乏（data deficiencies）更新為瀕危（endangered）。因此鱟資源的保護與恢復已迫在眉睫，而人工育苗和人工增殖放流是恢復鱟資源種群數量行之有效的措施之一［7］。

消化系統是動物對食物進行消化、吸收、排出的主要場所，是動物新陳代謝的基本保證，直接關系到動物的生長和發育。研究水產動物消化系統的發育過程有助于人們從根本上了解不同時期幼體消化系統的完善程度，從而在育苗生產中能準確掌握苗種開口期的餌料需求，這對養殖及餌料營養等方面的研究具有重要的現實意義。相關研究在國內外已有不少報道，研究對象主要集中在魚類［8-12］、蝦［13-14］、蟹［15-16］等經濟型水產動物。消化道是消化系統的主要組成部分，觀察消化道組織的發育是了解其攝食、消化及吸收營養物質過程機制的主要途徑，在魚類、甲殼類及較低等的環節動物等均有較多的研究［17-22］。然而國內關于鱟的消化道組織學研究較少見，呂林蘭和董學興［23］和劉正琮等［24］分別對圓尾鱟（Carcinoscorpiusrotundicauda）和中國鱟的消化道組織結構進行了觀察，謝木嬌等［25］對圓尾鱟消化道粘液細胞分布進行了研究，陳秀荔［26］和劉偉茹［27］對圓尾鱟和中國鱟消化道進行了組織學比較分析。而關于中國鱟消化道發育過程的組織學研究在國內外更是鮮見報道。研究表明，目前鱟的消化道劃分尚無統一的標準［26］，本文參考洪水根［28］的劃分方法將中國鱟的消化道劃分為食道、胃、中腸、直腸等幾大部分，采用石蠟連續切片和H-E染色技術，對15日齡～2齡及成年中國鱟的消化道發育過程進行組織學觀察，初步探討其結構與功能的關系，以期為后續中國鱟幼體消化生理、生化方面的研究奠定基礎，也為苗種科學管理和營養飼料的合理選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用中國鱟均來自廣東省湛江市中國水產科學研究院南海水產研究所中國鱟研究基地。

1.2 實驗方法

2018年5—9月在廣東湛江對中國鱟進行人工繁育技術研究［17］。在水溫28～32℃、鹽度26～30、pH 7.4～7.8的條件下，受精卵經歷約45 d胚胎發育孵化成1齡稚鱟，又經約90 d發育蛻殼進入2齡。從孵化后第1天開始，直至1齡稚鱟蛻殼進入2齡，每天取稚鱟10尾；成年個體解剖取出消化道，分離食道、胃、中腸和直腸。樣品置于4%多聚甲醛中固定24 h后，轉入70%的乙醇中保存。將固定好的樣品流水沖洗12 h，經50%～100%梯度乙醇脫水（50%乙醇2 h、70%乙醇4 h、80%乙醇2 h、85%乙醇2 h、95%乙醇45 min×2、100%乙醇45 min×2），二甲苯透明（1／2無水乙醇＋1／2二甲苯混合液1 h、二甲苯15 min×2），浸蠟（石蠟2 h×2），石蠟包埋，以4～6μm的厚度進行縱向連續切片，蘇木精-伊紅（H-E）染色，中性樹脂封片，在ZEISS Axio Scope.A1型光學顯微鏡下觀察并攝影記錄。

2 結果與分析

2.1 食道

15日齡，食道壁僅見黏膜層和黏膜下層，肌層與漿膜尚未形成。黏膜層和黏膜下層形成2～3個較寬大的黏膜皺褶向腔面突起，食道腔較小。黏膜層為單層柱狀上皮，上皮細胞高柱狀，界限模糊，頂部著色較淺，核基位，深染，此時尚未有幾丁質層形成，亦未見有纖毛。黏膜下層與疏松結締組織交替，界限不清晰，其中有零星肌纖維及游走細胞分布（圖版Ⅰ-A）。26日齡，食道腔稍有增大，黏膜皺褶仍為2～3個，黏膜層呈紫紅色，細胞界限模糊，黏膜上皮頂層著色加深且形成一深色條帶，疑似纖毛層或初期的幾丁質層。黏膜下層與疏松結締組織界限仍未區分，但其中肌纖維開始延伸（圖版Ⅰ-B）。至60日齡，食道腔明顯增大，黏膜皺褶增加至4～5個。黏膜上皮細胞的細胞核開始清晰，基位，深染，上皮細胞頂部出現纖毛，形成淺紅色的紋狀緣。黏膜下層與疏松結締組織界限開始逐漸形成，其之間的肌纖維數量增加，形成肌纖維環及其他單體肌纖維束，趨向于形成肌肉層（圖版Ⅰ-C）。

2齡，食道直徑及其內腔均明顯較前期大，黏膜皺褶增加至9～12個，其中大皺褶為6～7個，小皺褶為4～5個，大皺褶靠近頂部有分叉。黏膜層的上皮細胞界限不清晰，但其細胞核較清晰，呈紫紅色，基位。黏膜上皮頂部的紋狀緣消失，開始形成一小薄層幾丁質層，呈粉紅色。黏膜層和黏膜下層開始區分。肌肉層開始出現，由8～10個肌纖維束環組成，其細胞核深染，結構清晰，肌纖維束環之間有少數結締組織分布，兩者共同形成肌肉層。肌肉層外形成有結締組織薄膜組成的漿膜層，與周圍疏松結締組織區分明顯。此時食道的組織結構基本發育完善（圖版Ⅰ-D）。

成年中國鱟，食道可解剖分解，上端為口，下端與前胃相連。其組織結構由內到外由幾丁質層、黏膜層、黏膜下層、肌肉層及漿膜5層結構組成。各層結構完整且區分明顯。黏膜皺褶高度和寬度均較前期大，10～12個，多為分叉，往腔面突起幾乎充滿整個內腔。幾丁質明顯較前期厚，往黏膜層延伸，靠腔面一側形成染色較深的外緣帶。肌肉層緊密且較厚，其間的結締組織較少（圖版Ⅰ-E）。

2.2 胃

15日齡，胃壁的黏膜層和黏膜下層尚未區分明顯，共同向胃腔突起形成6～8個黏膜皺褶，皺褶較矮，胃腔較大。黏膜層為單層柱狀上皮，細胞矮柱狀，核基位，呈紫紅色。黏膜下層與肌肉層亦尚未區分，肌肉層僅有3～5個肌纖維環及大量結締組織組成。漿膜由結締組織及間皮細胞組成，外與疏松結締組織相連（圖版Ⅰ-F）。26日齡，胃壁黏膜層的上皮細胞呈高柱狀，核基位，嗜堿性增強，著色加深，細胞頂部形成深染的外緣，或將發育形成幾丁質層。黏膜皺褶增高，呈波浪形排列。肌肉層的肌纖維增加，形成數個環形肌束，其中仍有較多的結締組織分布。漿膜著色加深，與周圍疏松結締組織開始區分明顯（圖版Ⅰ-G）。至60日齡，胃壁黏膜上皮細胞嗜堿性增加，呈深紫色，細胞頂部深染外緣擴大且著色加深，形成纖毛狀向腔面游離。黏膜皺褶高度變化不明顯。肌肉層的肌束增加，紅染區域增大。漿膜層的間皮細胞嗜堿性增強，核深染（圖版Ⅰ-H）。

2齡，胃壁黏膜皺褶迅速增高，有13～15個，往腔面呈指狀突起，其頂部已形成較厚的幾丁質層。黏膜上皮細胞高柱狀，核較大，基位，呈深紫色；肌肉層增厚，為環肌，結締組織減少；漿膜與周圍結締組織界限明顯；此時胃組織結構基本形成（圖版Ⅰ-I，J）。

成年個體，胃的解剖結構可分為前胃和幽門。前胃黏膜皺褶呈波浪形向胃腔突起，頂部呈指狀或鐘形，有14～16個，其幾丁質層較厚。黏膜下層有放射肌，肌肉層發達，厚度明顯較前期厚（圖版Ⅰ-K）。幽門部由幽門內壁、幽門外壁及腸壁組成，前端連接前胃，后端深入腸腔形成一套疊結構，均有波浪形或鋸齒狀的黏膜皺褶向幽門腔和腸腔突起（圖版Ⅰ-L）。此為發育完全的胃組織結構。

2.3 中腸

15日齡，中腸壁黏膜層與黏膜尚未區分，有6～8個黏膜皺褶向中腸腔突起。黏膜層為單層柱狀上皮，細胞呈矮柱狀，核基位，細胞頂部邊緣著色較深，或將發育形成紋狀緣。肌肉層尚未形成，僅有1～2個肌纖維束環及結締組織形成。漿膜與周圍疏松結締組織尚未區分明顯（圖版Ⅱ-A）。30日齡，中腸壁黏膜層與黏膜下層界限不明顯，黏膜上皮頂部形成粉紅色的紋狀緣；黏膜皺褶高度增高，向中腸腔延伸。肌肉層的肌纖維束增厚，還有其他肌纖維及結締組織。漿膜層著色較深，與周圍疏松結締組織開始區分（圖版Ⅱ-B）。70日齡時，中腸壁組織結構清晰，黏膜皺褶高度增高，有9～11個，向腸腔延伸，上皮細胞嗜堿性增強，細胞界限不清晰，核基位，紋狀緣著色加深。肌肉層為肌纖維束環，漿膜為結締組織及間皮細胞組成，著色加深（圖版Ⅱ-C）。

2齡，中腸壁各層組織結構已區分明顯，黏膜皺褶幾乎充滿腸腔，紋狀緣明顯增厚，未見有幾丁質層結構形成。肌肉層增厚，多為環肌。漿膜與周圍疏松結締組織分離（圖版Ⅱ-D）。

成年個體，中腸壁完整結構由黏膜層、黏膜下層、肌肉層和漿膜組成（圖版Ⅱ-E）。黏膜上皮頂部為較厚的紋狀緣，無幾丁質層包裹。黏膜皺褶寬大，多為分叉，形成鋸齒狀。黏膜上皮細胞高柱狀，核基位，頂部為粉紅色紋狀緣，上皮底部為深紅色的基帶與黏膜下層隔開。黏膜下層與肌肉層界限不清晰。環肌和縱肌及結締組織交錯。漿膜為間皮和結締組織（圖版Ⅱ-F）。此為發育完全的中腸壁組織結構。

2.4 直腸

15日齡，直腸壁各層結構尚未區分，僅見較厚黏膜層，向腸腔形成波浪形皺褶，腸腔較小。黏膜層外僅有一側有少量肌纖維形成；漿膜層與周圍結締組織尚未區分（圖版Ⅱ-G）。30日齡，直腸直徑增大，黏膜皺褶4～5個，黏膜上皮嗜堿性增強，上皮細胞矮柱狀，核基位，頂部形成粉紅色紋狀緣。黏膜下層與肌肉層尚未區分，肌纖維增加形成肌纖維束環。漿膜與周圍疏松結締組織界限不清晰（圖版Ⅱ-H）。至70日齡，直腸壁黏膜層嗜堿性增強，上皮頂部的紋狀緣著色加深；黏膜下層與肌肉層仍未明顯區分；肌肉層肌纖維束增厚；漿膜層有一側與周圍疏松結締組織分離（圖版Ⅱ-I）。

2齡，直腸直徑明顯增大，直腸壁由黏膜層、黏膜下層、肌肉層及漿膜組成。黏膜皺褶10～12個，呈指狀向腔面突起；黏膜上皮頂部幾丁質層發育形成，多有分叉，呈鋸齒狀包裹黏膜上皮。黏膜下層與肌肉層界限不明顯，肌肉層增厚，由肌纖維束及結締組織形成。漿膜明顯，由間皮和結締組織形成，與周圍結締組織分離（圖版Ⅱ-J）。此時，直腸各層組織結構基本發育完成。

成年個體，直腸可解剖分離，直徑較大。直腸壁幾丁質層、黏膜層、黏膜下層、肌肉層及漿膜均明顯較前期厚。幾丁質層較厚，多有鋸齒狀突起，其下為深染的條帶與黏膜層隔開。黏膜皺褶為波浪形，有10～15個大型皺褶，各大型皺褶上分多個次級皺褶。黏膜上皮細胞矮柱狀，核基位，嗜堿性較強。黏膜下層分布有較多大小不一的放射肌。肌肉層厚，內層為不連續環肌，外層為縱肌。漿膜亦增厚，由間皮及結締組織組成（圖版Ⅱ-K，L）。此為發育完全的直腸結構。

3 討論

3.1 中國鱟消化道發育的組織學特征

中國鱟消化道組織結構的發育過程呈現逐漸復雜的規律。15日齡，消化道各段組織結構基本類似，黏膜層最早形成，黏膜層是黏液腺及黏液細胞分布的主要部位［29］，其主要功能是分泌黏液，在保護潤滑、消化吸收、免疫防御、離子轉運等方面具有重要作用［30-32］。黏膜層的形成，為食物的消化吸收提供了基本可能，黏膜上皮由多種不同的細胞組成，包括柱狀細胞、內分泌細胞、黏液細胞，這些細胞的分泌物起到潤滑作用并參與了消化過程。此時，黏膜層與黏膜下層向消化道內腔凸起形成較矮的黏膜皺褶，擴大了消化道與食物的接觸面積，以便提高消化能力。肌層尚未形成，說明此時稚鱟的消化道收縮能力較弱，其攝食能力較弱或尚未開始攝食。26日齡，食道和胃的黏膜上皮頂部出現深染條帶，根據劉正琮等［24］對中國鱟消化道的研究，該條帶可能是幾丁質層或紋狀緣的早期階段。30日齡，中腸和后腸的黏膜上皮頂部形成粉紅的紋狀緣，紋狀緣為發達的微絨毛，可進一步加大吸收面積［26］；消化道各段肌纖維數量增加，其收縮能力增強。60日齡，消化道黏膜皺褶明顯增高，肌肉層形成；食道和胃黏膜上皮頂部深色條帶發育成紋狀緣，至70日齡，中腸和直腸的紋狀緣著色加深，表明其消化功能逐漸增強。到2齡，中國鱟消化道組織由黏膜層、黏膜下層、肌肉層及漿膜組成，各層區分明顯。其中，食道、胃和直腸的黏膜上皮頂部有幾丁質層包裹，而中腸黏膜上皮頂部為紋狀緣，這與劉正琮等［24］和陳秀荔等［26］對成年中國鱟消化道的研究結果基本一致，表明2齡中國鱟的消化道組織結構基本完善，具備基本的攝食及消化能力。成年中國鱟消化道可在解剖學上劃分為食道、胃（前胃和幽門）、中腸和直腸等部分，在組織學上各部分可明顯區分，食道、胃和直腸的幾丁質層均明顯比2齡時要厚，黏膜皺褶和肌肉層十分發達，其中黏膜下層有較多的放射肌分布，該結果與其他學者的結果基本一致，這是與其消化功能相適應的體現［23-24，26］。

3.2 中國鱟消化道組織結構發育與攝食的關系

鱟為雜食性動物，其自然餌料十分復雜［26］。ELZINGA［33］運用穩定同位素標記的方法對鱟的食性進行研究，結果表明較小齡期的幼鱟主要依賴腐屑及粘附在基底質上的有機微粒為主要餌料，隨著年齡的增長逐漸過渡為多毛類及甲殼類，成鱟則以更大的雙殼類及腹足類為食。另外，圓尾鱟及中國鱟幼體也喜食昆蟲幼蟲、小型多毛類等小型食物［34］。而陳秀荔等［26］和劉偉茹［27］通過對中國鱟和圓尾鱟消化道外部形態觀察、形態測量、組織切片觀察及形態指數的定量分析，表明中國鱟與圓尾鱟消化道形態組織結構與其雜食性密切相關。本研究結果顯示，1齡稚鱟消化道組織發育較為緩慢，組織結構尚未完善，肌肉層尚不發達，食道和胃的幾丁質層尚未形成，并不具備攝食和消化大型餌料的能力，因此推測正處于消化道發育初期階段的1齡稚鱟主要消耗內源性營養，尚未開始攝食或僅攝食少量腐屑或有機微粒來加強消化道的發育。有研究顯示，將1齡稚鱟置于高密度餌料的水體中飼養，并未觀察到其進食，由此推測1齡稚鱟并未開始攝食，僅由卵黃提供營養［35］。2齡幼鱟的消化道發育基本完善，與成鱟的組織結構基本類似，其食道的幾丁質層和肌肉層開始形成，為攝食和消化提供了可能，幾丁質層可保護食道不被食物損傷，肌肉層的形成增加了食道的收縮能力，有助于將食物向胃推進，加上發達的黏膜皺褶，增加食物與消化道的接觸面，可暫時容納食物，使之與黏液充分接觸，更利于食物的推進；胃發達的黏膜皺褶及其表面的幾丁質層以及發達的肌肉層可有效研磨食物，使之免受損傷；中腸形成發達黏膜皺褶和微絨毛，增加了吸收面積，符合消化吸收主要場所的典型特點；直腸發達的黏膜皺褶便于食物殘渣中的水分和無機鹽回收利用，從而調節血液的滲透壓和離子平衡，幾丁質層可使直腸壁在殘渣向肛門推移的過程中免受損傷［26-27，36-37］。中國鱟2齡個體消化道組織結構特點表明該時期開始具備攝食及消化的能力，此階段應是幼鱟開始攝食的關鍵時期。此外，對中國鱟攝食規律進行觀察研究發現，中國鱟在2齡時開始攝食豐年蟲，本研究結果與之相吻合［35］。成年中國鱟消化道的組織結構進一步發育完善，幾丁質層及肌肉層顯著增厚，黏膜皺褶增高，且黏膜下層出現放射肌，增加了消化道的蠕動和消化吸收功能［35］，喻示成年中國鱟的攝食能力已明顯增強，可捕獲較大的多毛類和甲殼類作為主要食物［33］，食量也會進一步增加以滿足其生長發育的需要。

中國鱟的消化生理研究文獻匱乏，如黏液細胞的發育特征及消化酶活性的變化與攝食習性的關系等，亟需進一步多角度開展研究。本研究結果補充了中國鱟的基礎生物學內容，可為今后開展其他消化生理學研究、資源開發利用和保護提供理論參考。

圖版Ⅱ 中國鱟中腸和直腸的發育PlateⅡ Development ofm idgut and rectum in T.tridentatus