三亞河紅樹林土壤纖維素降解菌的分離

曾德華,吳志祥，趙懷寶，劉 俊，寇旭陽，張 源

(1．三亞市林業科學研究院，海南 三亞572022；2.海南熱帶海洋學院a.熱帶海洋生物資源利用與保護教育部重點實驗室；b.生態環境學院，海南 三亞 572000)

0 引言

紅樹林是熱帶、亞熱帶海灣、河口泥灘上特有的常綠灌木和小喬木群落；它生長于陸地與海洋交界帶的灘涂淺灘，是陸地向海洋過渡的特殊生態系統。紅樹林不單是部分海洋生物的棲息地，還具有防浪護堤、納污及凈化等生態功能，具有較高的工業、藥用及旅游開發價值。紅樹林生態系統具有高生產力，高歸還率和高分解率的“三高”特點，其中的微生物發揮著重要作用。紅樹林底質中存在的微生物資源，不僅具有陸源微生物的基本特征，而且通常具有降解或轉化有機污染物的巨大潛力，在物質循環中發揮著重要作用[1]249,[2]562。

近年來，紅樹林生態環境中的微生物資源引起了科學家的高度關注，對來自世界各地區紅樹林環境的微生物進行了研究。Sengupta和Chaudhuri[2]562從不同紅樹林沉積物和根系中分離得到Azospirillum、Azotobacter、Rhizobium、Clostridium和Klebsiella等固氮菌。Holguin等[3]257研究了紅樹林生態系統中參與營養轉運的微生物，發現固氮菌、溶磷菌和真菌較多。印度學者Ananda等[4]872研究了西海岸紅樹根際內生真菌的多樣性。Jalal等[5]640從馬來西亞紅樹林沉積物中分離到多種細菌，如Chromobacteriumviolaceum、Pseudomonasaeruginosa、Serratiarubudaea、Klebsiellapnuemoniae等。Baskaran等[6]28從印度安達曼紅樹林沉積物中分離到42株放線菌，其中大部分為鏈霉菌屬。楊曉洪等[7]99,[8]118在八門灣紅樹林分離到23個細菌類群、22個古菌類群、15個真菌類群，12個放線菌類群。高兆明[9]36研究發現紅樹林地區絕大多數真菌都能產生木質纖維素酶。戴旭青[10]36研究發現78株具有降解纖維素能力的菌株，大部分為真菌，放線菌次之，細菌最少。謝為天等[11]157在紅樹林中篩選出一株名為解淀粉芽孢桿菌的菌株，具有產淀粉酶及蛋白酶的能力，其酶具有較強的穩定性。趙艷娟[12]107采用18種放線菌培養基在北海紅樹林根際土壤中分離出42株放線菌，其中一株鏈霉菌屬菌株有淀粉酶活性、無纖維素酶活性。姚琦等[13]859研究發現，土壤微生物群落多樣性隨著月份變化有著顯著的變化，突出表現在12月份土壤微生物群落有較強的活性，但2月份土壤微生物具有物種多且分布均勻的特征。麥國琴等[14]180從深圳福田紅樹林土壤中分離了80株真菌，經過產酶發酵復篩，獲得2株同時具有較高木聚糖酶和纖維素酶活的真菌。其中一菌株木聚糖酶和纖維素酶的酶活分別為39.01 IU 和 0.87 IU。馮玲玲等[15]1357在研究海南三亞紅樹林底泥中放線菌多樣性和抗菌活性，共分離到149株放線菌，隸屬6個目12個科16個屬，其中小單抱菌屬為優勢屬；其中20株放線菌具有抗菌活性，82株放線菌含有生物合成基因，表明海南三亞紅樹林含有豐富的藥用放線菌資源，具有從中發現新穎活性物質的潛力。馬軍等[16]999從紅樹林根際土壤中篩選出一株產纖維素酶的革蘭氏陽性菌，經分析鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。曾思泉等[17]39利用水解圈法從三亞紅沙河紅樹林區分離得到1株纖維素降解真菌 SCSIO 43503。經過分子生物學鑒定并綜合形態學特征，推測其為枝孢屬(Gladaxporism) 真菌。

三亞河紅樹林物種豐富、古老，得天獨厚的條件也孕育了豐富的微生物資源。隨著城市快速發展，特別是排污等影響，其生境也不同程度受到了影響。研究和開發紅樹林沉積物中的微生物，不僅有助于理解生態學過程，而且可應用于紅樹林生態系統的監測、管理及恢復。從三亞河紅樹林底質中篩選出具有降解纖維素能力的菌株，進行分離、純化，對其形態學特征和生理生化實驗做初步鑒定，進行酶的活性研究，為后續開發利用做準備。

1 研究方法與材料

1.1 采樣地點設置

三亞河紅樹林自然保護區位于18°19′～18°37′N，108° 36′～109°46′E。在三亞河沿岸紅樹林中根據不同群落、不同的河道區段，選取7個樣地進行采樣。

1.2 取樣

在每一樣地，采用五點法對每一個樣品進行取樣。在每個點取0～5 cm，5～10 cm，10～15 cm，15～20 cm，25～30 cm的土壤若干，將各個點的同一深度土樣混合，并做標記，待用。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基

(1) 羧甲基纖維素鈉平板分離培養基

羧甲基纖維素鈉10.0 g 、蛋白胨10.0 g 、酵母膏5.0 g 、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 10.0 g、瓊脂20.0 g、水1 000 mL，121 ℃ 滅菌20 min 。

(2) 剛果紅纖維素瓊脂培養基

KH2PO40.5 g 、(NH4)2SO42 g、 纖維素粉 1.88 g 、MgSO4·7H2O 0.25 g 、剛果紅 0.2 g 、瓊脂 18 g、水1 000 mL，121 ℃ 滅菌20 min 。

(3) 羧甲基纖維素鈉液體培養基

羧甲基纖維素鈉10.0 g、蛋白胨 10.0 g 、酵母粉5.0 g 、KH2PO41.0 g 、MgSO4·7H2O 0.2 g 、NaCl 10.0 g、水1 000 mL，121 ℃ 滅菌20 min[18]146。

(4) 蛋白胨液體培養基

蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、水1 000 mL、pH值為7.2～7.4 ，121 ℃ 滅菌20 min 。

(5) 葡萄糖蛋白胨液體培養基

葡萄糖 5.0 g、蛋白胨5.0 g、NaCl 5.0 g、水1 000 mL、pH值為7.2 ～ 7.4，121 ℃ 滅菌20 min[19]151。

1.3.2 樣品預處理

去除植物殘體等雜物，準確稱取10.0 g土樣，加入至裝有 90 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，用玻璃棒攪拌均勻。放入30 ℃、200 r·min-1條件下的振蕩培養箱中40 min，靜置2 h，取上清液便得10-1稀釋菌液。取1 mL菌液，加入裝有9 mL無菌水的試管中，反復吹打5次使菌液混合均勻，便得10-2菌液。按照上述方法，得到濃度為10-1、10-2、10-3、10-4四個梯度的菌液。

1.3.3菌株的初篩、復篩及菌株的分離

取10-2、10-3、10-4的適量菌液涂布于羧甲基纖維素瓊脂分離培養基上，倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養。每隔12 h觀察一次，培養36 h后取出對菌落進行觀察，根據菌落形態挑選菌落。將挑選出來的菌落重復劃線接種于羧甲基纖維素鈉平板分離培養基，直至純化出形態穩定的單個菌落，觀察并記錄其菌落形態指標。

將挑選純化出的單個菌落接種于裝有15 mL羧甲基纖維素鈉液體培養基的25 mL的試管中，置入37 ℃、180 r·min-1條件下的振蕩培養箱中培養4 d。將培養的試管充分振蕩后用移液槍吸取菌液，點接法接種于剛果紅纖維素瓊脂培養基中，每個平板中接一種菌株,且菌液對稱的接種4個位置。將平板放入37 ℃的恒溫培養箱中培養，每12 h觀察一次，48 h后觀察透明圈，并記錄菌落的直徑(d)、透明圈的直徑(D)，計算D/d值。

1.3.4 菌株的鑒定

根據菌落的形態學特征初步鑒定菌株的種屬，對復篩出 D/d 值排名前三的菌株參考《微生物實驗教程》[20]351做生理生化實驗，包括甲基紅試驗(MR試驗)、吲哚試驗、乙酰甲基甲醇試驗(vp試驗)、溴甲酚紫試驗、葡萄糖發酵產氣實驗、革蘭氏染色實驗。

1.3.5 纖維素粗酶活性測定

將復篩得到降解纖維素能力強的3 種菌株接種于裝有15 mL液體培養基的試管中，在37 ℃、180 r·min-1條件下的振蕩培養5 d。在4 ℃ 、4 000 r·min-1，離心20 min；用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，在4 ℃、4 000 r·min-1，離心10 min ；使用超聲波處理20 min，在4 ℃、5 000 r·min-1，離心20 min，取上清液即得粗酶液。將粗酶液用乙酸-乙酸鈉緩沖液，稀釋10倍。

(1) DNS法測定最適波長的確定。 關于使用DNS法測定還原糖所用波長，在400～550 nm 都有報道[21]197,[22]535。取2 mL葡萄糖標準溶液和2 mL 蒸餾水置于試管中，再各加2 mL DNS試劑，沸水浴10 min，流水冷卻，定容至15 mL，在400～740 nm 比色。

(2) 葡萄糖標準曲線的繪制。如表1所示配制溶液，測定吸光值，應用SPSS作回歸分析。

表1 葡萄糖標準曲線吸光值測定

(3) 纖維素酶活性測定。 吸取粗酶液0.2 mL 加入試管，加1%羧甲基纖維素緩沖液 1.8 mL混勻；在 40 ℃ 保溫 30 min 后，加入DNS試劑 2 mL，混勻后置于沸水浴中加熱10 min；流水冷卻，在選定最適波長下比色，根據葡萄糖標準曲線進行計算。定義酶活性單位( U) ：在40 ℃、pH6.8的條件下，每分鐘內生成 1 μg·mL-1葡萄糖所需要的酶量(U·mL-1)[23]151,[24]3,[25]58。使用酶活性公式

計算酶的活性含量，其中：U為所測酶的活性，單位為U·mL-1；x為樣品OD值的平均值；a、b由葡萄糖標準曲線回歸方程確定；n為粗酶稀釋倍數；T為酶促反應時間；0.2為所加酶液的體積。

2 結果與分析

2.1 菌株的初篩

將 10-1、10-2、10-3、10-4稀釋菌液分別涂布于羧甲基纖維素鈉瓊脂培養基在37 ℃恒溫培養箱中倒置培養，36 h 后根據其菌落形態挑取單個菌落，使用平板劃線法純化于羧甲基纖維素鈉瓊脂培養基，共篩選、純化出12株具有降解羧甲基纖維素鈉能力的菌株。

2.2 菌株的復篩

經觀察并統計，對透明圈直徑及菌落直徑記錄，發現6株菌株可以產生透明圈，結果見表2。

表2 菌株的篩選

通過上述實驗，共篩選出12株菌株具有羧甲基纖維素鈉降解能力，在進行復篩時卻發現，只有6株菌株能夠產生透明圈。這說明SW-1、SW-4、SW-5、SW-9、SW-10、SW-11 菌株能夠利用羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，但不能利用纖維素；或者說它們不適合在液體培養基培養。

2.3 菌株的鑒定

12株菌株通過連續5次的平板劃線接種，各菌株出現穩定形態的菌落，菌落描述見下表3。

表3 12種菌株的形態學描述

可以看出，這些菌株之間的形態差異較大。在顏色上，有亮黃色、也有乳白色；菌落大小上，最小的菌落SW-9僅0.8 mm，最大的菌落SW-6約5.6 mm；形狀有突起也有扁平，產長菌絲也有短菌絲。

將D/d值排名前三的菌株SW-2、SW-3、SW-8進行生理生化實驗，其結果見表4。

表4 菌株SW-3、SW-8、SW-2生理生化測定

根據表3 、表4 結果，結合《伯杰細菌手冊》[26]3，初步鑒定SW-3 菌株為枯草芽孢桿菌，SW-8 菌株疑似芽孢桿菌屬一種。

2.4 纖維素酶活性的測定結果

2.4.1最適波長的確定

DNS法測還原糖含量的條件各異，對還原糖的測定也產生一定的影響[27]95,[28]84。考慮到各種因素對實驗的干擾，結合文獻報道，在 400～740 nm測定結果見圖1。

圖1 用DNS測定還原糖含量在不同波長下的吸光值

從圖1中可以看出，DNS試劑與葡萄糖反應后的生成物在400～720 nm 范圍內都有吸收值，在480～600 nm 范圍內有明顯的吸收值。而DNS試劑在400～540 nm范圍內具有吸光值，540 nm處基本不存在吸光值。為了避免DNS 試劑吸光值對生成物吸光值造成影響，所以要根據“吸收最大，干擾最小”的原則，選定的最適波長應該在生成物具有較顯著的吸光值，而且DNS試劑的吸光值處于低水平。540 nm 處生成物具有較顯著的吸光值，而且DNS試劑的吸光值處于低水平，所以選擇540 nm 進行還原糖測定，以提高了測定結果的準確度[29]156。

2.4.2葡萄糖標準曲線的繪制

根據表2配制的溶液，測得對應的吸光值(A)，繪制的葡萄糖標準曲線為y=0.874 3x-0.022 4，線性回歸系數R2=0.996 5，可用于酶活性測定。

2.4.3纖維素酶活性測定結果

將復篩得出的SW-3 、SW-8 、SW-2分別加入羧甲基纖維素液體培養基中，在37 ℃、180 r/min條件下的振蕩培養箱中培養 5 d。經離心、破碎和稀釋，制取 10-1粗酶液，使用DNS 法測定的纖維素粗酶活性見表5。

表5 三個菌株纖維素粗酶活性

由表5可以看出，SW-3菌株的酶活性最高，為849.805 U·mL-1，是SW-8酶活性的1.29倍，是SW-2菌株的1.75倍，而SW-8菌株酶活性是SW-2菌株的1.36倍。

3 討論

紅樹林生態系統是熱帶、亞熱帶海岸帶海陸交錯區重要的、特殊的生態系統，具有維持生物多樣性、防風消浪的作用，對重金屬、石油和生活污水等有較強的納污能力，對污染物有較強的凈化功能，而微生物在紅樹林生態系統中發揮著重要作用[30]449。

本研究檢測到的12株菌株對羧甲基纖維素鈉具有降解能力，細菌最多；其中有6株菌株能夠降解纖維素，占總量的50%。對降解能力較高的3株菌株進行了形態學及生理生化鑒定，得出降解能力最強的菌株SW-3為枯草芽孢桿菌，其粗酶活性為849 U·mL-1。篩選菌株的多與少，與取樣地點、季節、使用的培養基、樣品菌液的制備以及研究者對不同菌落的辨別能力都有關系，這還有待進一步比較和研究。

如何在剛果紅瓊脂培養中接種是一個值得研究的問題。研究中采用了菌落點接法和打孔菌液接種法。其中菌落點接法接種試驗中，培養3 d后未出現透明圈；打孔菌液接種法是在菌落上打孔，在孔中注入菌液培養，在實驗中并未出現張潔娜等[19]151所述菌落生長，只見透明圈出現，不具評判菌種降解能力的意義。鑒于接種方法對透明圈的產生具有一定的影響，所以應該對接種方法進行比較研究，選擇對透明圈產生影響最少的方法進行接種。同時還要考慮到菌種的接種量對透明圈產生的影響。

在酶活性測定方面，戴旭青等[24]113研究表明，篩選出的78株降羧甲基解纖維素鈉的菌株大部分是真菌，放線菌次之，細菌最少，酶活性最大值為1 074 U·mL-1。本研究中共篩選出 12 株菌，細菌最多，真菌次之，放線菌最少；40 ℃、pH 6.8條件下酶活性為849 U·mL-1，與上述研究有一定差異性。出現這種原因可能是從土樣中篩選出的菌株較少，對統計影響較大。馬軍等[16]977篩選出一株產纖維素酶的枯草芽孢桿菌，在55 ℃、pH 6.8 條件下酶的活性為(1 253.2±16.629) U·mL-1。本研究中粗酶的活性低于其所測值，原因可能在于試驗所用粗酶液未進行提純且未進行最適溫度、pH值測試。梁倩等[31]122篩選出3種菌，其所產纖維素酶學活性分別為977．92、1 089．79和 1 538．44 U·mL-1。從文獻中來看，真菌的纖維素酶活性低于芽孢桿菌。

DNS 法在測定還原糖含量的眾多方法中憑著其簡便、快速的特點被廣泛使用，但其中存在各種因素的干擾，確定測定的波長是DNS 法測定的重中之重。在本研究中，將各因素(葡萄糖、顯色液、水)在400～740 nm 波長下進行測定，本著“吸收最大，干擾最小”的原則，選定了540 nm 的波長。王俊麗等[32]157研究發現，根據回歸系數和比耳定律，在葡萄糖含量為0～40 mg·L-1，520 nm為最適測定波長。本研究中采用的是1 mg·mL-1葡萄糖標準溶液，遠高于文獻所用濃度，所以最適波長有所差別。劉最等[33]48、程鵬等[23]3、高建民[34]6等采用的也都是540 nm 的波長。

在今后的研究中，需要對菌株SW-3進行細化的研究，包括應用16sRNA、ITS 序列測定[35] 64,[36]42，構建系統發育樹；對其生長曲線進行測算，探索最佳繁殖條件。對其所產纖維素酶進行純化及性質分析，對酶的最適溫度、最適pH值以及金屬離子對酶活性的影響進行研究，以及對菌株的生長曲線和酶活性變化對應關系和酶的穩定性進行研究，為制備降解纖維素菌劑提供依據。

4 結論

研究共篩選出12株具有降解羧甲基纖維素鈉能力的菌株，其中細菌最多，真菌次之，放線菌最少。對12株菌種進行復篩，得到6株菌株具備降解纖維素能力，其中菌株SW-3的降解能力最強，鑒定其為枯草芽孢桿菌，其粗酶活性為849 U·mL-1。