升陷湯治療低血壓性腦梗死的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作用機制研究*

壽昕洋 張弈舒 陳 冰 陳思邈 陳偉燕 裘 濤 張宇燕

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

缺血性腦卒中具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點［1-2］。低血壓性腦梗死在缺血性腦卒中危險因素中占有重要地位［3］。升陷湯由黃芪、柴胡、升麻、知母和桔梗組成，始載于張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，治“大氣下陷”所致諸癥。目前升陷湯臨床用于心腦血管疾病的治療，對低血壓［4］、慢性心力衰竭［5］、分水嶺腦梗死［6］、腦卒中后眩暈［7］均有較好的臨床療效。升陷湯對低血壓性腦梗死的研究，大多數(shù)集中于臨床應(yīng)用及對組方中藥及成分的研究。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從多成分、多靶點與多通路的角度闡釋藥物、靶點、疾病間相互作用的整體性，為多成分的中藥作用機制研究提供方法［8］的優(yōu)勢，開展中藥復(fù)方升陷湯組分、成分、作用靶點與低血壓性腦梗死的病理機制的相互關(guān)系分析，探討升陷湯治療低血壓性腦梗死及改善預(yù)后的作用機制。

1 方 法

1.1 升陷湯組分藥物的活性成分、藥物靶點篩選 運用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）篩選升陷湯活性成分、藥物靶點。

1.2 低血壓性腦梗死相關(guān)基因篩選 在OMIM、GEN-ECARD、DRUGBANK等數(shù)據(jù)庫中，以“Hypotensive cerebral infarction”為關(guān)鍵詞，檢索與低血壓性腦梗死相關(guān)的基因。

1.3 活性成分-交集基因篩選 將1.1和1.2中篩選到的靶點分別上傳至韋恩圖，得到藥物靶點與低血壓性腦梗死相關(guān)基因的交集，稱交集基因。

1.4 交集基因名稱規(guī)范化 借助UniProt數(shù)據(jù)庫查詢“1.3”所得交集基因的基因名與ID，限定物種為人。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)和藥物-有效成分-交集基因網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將“1.4”中得到的交集基因輸入STRING，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為最高，并進行模塊化分析。將得到的TSV文件和藥物活性成分，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，以≥10的度值為篩選條件獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，以≥5的度值、≥1倍接近中心性的中位數(shù)及≥1倍介數(shù)中心度中位數(shù)獲得藥物-有效成分-交集基因網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 交集基因的模塊化通路分析 將1.4得到的模塊基因分別導(dǎo)入DAVID進行GO富集分析和KEGG通路分析，限定EASY為0.05，各取P值排名前十的條目。

2 結(jié) 果

2.1 升陷湯有效成分篩選 以“黃芪”“柴胡”“升麻”“知母”“桔梗”為關(guān)鍵詞，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為條件，刪除無靶點對應(yīng)的化合物，合并共有化合物，篩選出活性化合物69個。

2.2 交集基因篩選和藥物分類 并通過OMIM、GENECARD、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫和制作韋恩圖，篩選得到低血壓性腦梗死相關(guān)基因1 328個，藥物靶點197個，交集基因131個。

2.3 交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過STRING中的聚類分析（K-means算法），交集基因被分為3大模塊，結(jié)果顯示模塊一內(nèi)86個，模塊二內(nèi)25個，模塊三內(nèi)20個。將生成的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件分析，包含118個節(jié)點，538條邊，平均節(jié)點度值為9.11（見圖1），根據(jù)Degree值大小篩選出前10位的靶點（見表1）。

圖1 交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表1 度值排名前10的交集基因及其部分拓撲參數(shù)

2.4 藥物-有效成分-交集基因網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將升陷湯有效成分和交集基因?qū)隒ytoscape3.7.2軟件，建立藥物-有效成分-交集基因網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)共包括176個節(jié)點（40個化合物節(jié)點、131個靶點節(jié)點、5個藥物節(jié)點）。該網(wǎng)絡(luò)中每個化合物平均與10.50個靶點相互作用，每個靶點平均與3.20個化合物相互作用；從化合物的角度，有22.5%的化合物的作用靶點≥15個，其中靶點≥30個的化合物3個，經(jīng)分析度值排名前5位的化合物分別是槲皮素、木樨草素、山柰酚、7-O-甲基異丙炔醇和脫水淫羊藿素，分別能與93、42、33、23、19個靶點蛋白發(fā)生相互作用；從靶基因的角度，度值排名前5位的是PTGS2、PTGS1、AR、ADRB2、RXRA，分別能與31、23、14、13、12個化合物發(fā)生相互作用（見圖2）。

圖2 藥物-有效成分-交集基因網(wǎng)絡(luò)圖（度值≥5）

2.5 GO富集分析 PPI聚類分析后，交集基因分為3大模塊，結(jié)果顯示模塊一內(nèi)86個，模塊二內(nèi)25個，模塊三內(nèi)20個。將3個不同模塊內(nèi)的靶點分別進行GO分析，各取P值排名前10的條目（見圖3）。GO分析結(jié)果表明，升陷湯治療低血壓性腦梗死是多種生物學(xué)過程共同參與的，體現(xiàn)了升陷湯多靶點、多層次的作用特點。

圖3 各模塊靶點GO分析結(jié)果前10名

2.6 KEGG通路分析 KEGG通路富集得出靶點主要富集在癌癥相關(guān)（癌癥途徑、前列腺癌、膀胱癌、小細胞肺癌、結(jié)腸直腸癌、慢性骨髓性白血病、腫瘤壞死因子信號通路、癌癥蛋白多糖）、信號通路相關(guān)（cGMP-PKG信號通路、鈣信號通路、cAMP信號通路、PI3K-Akt信號通路、toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、甲狀腺激素信號通路、類節(jié)點受體信號通路）、傳染病相關(guān)（利什曼病、瘧疾、乙型肝炎、非洲錐蟲病、百日咳、南美錐蟲病、軍團菌病）、神經(jīng)活性配體受體相互作用、肌動蛋白骨架的調(diào)節(jié)（見圖4）。KEGG結(jié)果顯示，升陷湯通過多種疾病通路、信號通路改善低血壓性腦梗死預(yù)后。

圖4 各模塊靶點KEGG分析結(jié)果前10名

3 討 論

病理性低血壓可以導(dǎo)致腦灌注不足發(fā)生缺血性腦卒中，此類腦卒中為低血壓性腦梗死。中醫(yī)學(xué)無低血壓病名，一般辨病屬于虛勞，辨證屬于大氣虛損證，治以扶正補虛、益氣升陷法［3］。缺血性腦卒中的中醫(yī)病名往往被認為是“中風(fēng)”“厥證”“類中風(fēng)”等，辨證通常分為中經(jīng)絡(luò)和中臟腑，病邪以風(fēng)、痰、瘀為主，多治以息風(fēng)、豁痰、化瘀法［9］。升陷湯治大氣下陷所致諸癥，“大氣”早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》［10］中就被提及，后世醫(yī)家認為大氣即宗氣多出于此。張錫純在《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中對大氣的作用論述頗詳，張氏認為“至胸中大氣，獨名為大氣者，誠以其能撐持全身，為諸氣之綱領(lǐng)，包舉肺外，司呼吸之樞機，故鄭而重之曰大氣”［11］。升陷湯方中重用黃芪，其味甘，性微溫，兼具補氣、益氣之功；知母其性涼潤，不僅制黃芪之溫?zé)幔铱汕鍤庀葜魺幔佥o以柴胡、升麻與桔梗，以助其升提之效。柴胡、升麻為引經(jīng)藥，分別入少陽、陽明經(jīng)，以引下陷之大氣自左、右而升；桔梗味辛且微溫，可引藥入肺經(jīng)，導(dǎo)藥力直達胸中。氣虛甚者，加人參以培補元氣，顧護大氣之根，或加凈山茱萸肉以收斂大氣，防其耗散太過；下陷甚者，倍用升麻，以增全方升提之力［12］。同時張氏又在升陷湯一方后，附有回陽升陷湯、解郁升陷湯以及醒脾升陷湯三個變方，來治療大氣下陷兼加心肺陽虛、氣分郁結(jié)或脾虛諸證。臨床研究也表明升陷湯對低血壓性腦梗死治療及預(yù)后有較好的作用。

現(xiàn)代藥理研究表明，升陷湯中黃芪具有雙向調(diào)節(jié)血壓的作用，其升壓作用與增加心排血量和收縮血管有關(guān)［13］，黃芪總黃酮對腦缺血再灌注損傷大鼠具有明顯的保護作用，其可能與抑制氧化應(yīng)激水平、減少炎癥反應(yīng)、抗凋亡作用有關(guān)［14］；知母中皂苷類成分能增加腦血流量，減輕能量代謝障礙，抗氧化損傷［15］；柴胡皂苷A對腦損傷大鼠認知功能有明顯改善作用［16］；升麻苷H-1不僅能透過血腦屏障，同時可調(diào)節(jié)腦缺血興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的功能紊亂，對缺血腦組織神經(jīng)元有一定的保護作用［17］。

對單味藥、藥對、拆方的化學(xué)成分及其藥理作用的研究表明，升陷湯整方及組分、成分具有較好的治療腦梗死的作用，本研究在此基礎(chǔ)上，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)方法，通過“升陷湯活性成分-交集基因-通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的搭建、拓撲參數(shù)的分析及生物通路的信息挖掘，對升陷湯的活性成分、關(guān)鍵靶點及其分子機制進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)升陷湯活性化合物69個，交集基因131個，其中相關(guān)度最高的是槲皮素和木樨草素。而槲皮素和木樨草素均能通過調(diào)節(jié)ROS的生成，抑制IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ的表達，發(fā)揮其抗氧化及清除自由基、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖及免疫調(diào)節(jié)作用，減輕腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷［18］。

PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析結(jié)果顯示，升陷湯主要通過JUN、MAPK1、TP53、TNF、Akt1、RELA、MAPK14、IL6、APP、CXCL8等靶蛋白改善低血壓性腦梗死預(yù)后、減輕腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷。JUN編碼的蛋白是cjun，c-jun既可通過促進雙皮質(zhì)素（DCX）的表達來保護神經(jīng)元，同時也可激活Caspase蛋白家族以啟動細胞凋亡程序［19］。Akt1通過刺激血管內(nèi)皮生長因子、PI3K-Akt途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞遷移［20］，從而介導(dǎo)血管生成，改善腦缺血。升陷湯中活性化合物多為黃酮類化合物，可通過抑制炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB實現(xiàn)鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗炎的作用，減少TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子的產(chǎn)生，增強抗凋亡信號傳導(dǎo)，促進髓鞘再生，使神經(jīng)細胞內(nèi)部鈣超載減弱［21］。APP是結(jié)合銅的淀粉樣蛋白前體蛋白，與維持銅穩(wěn)態(tài)關(guān)系密切，可以被銅離子和生長因子樣結(jié)構(gòu)域（GFLD）刺激，加速突觸生成，改善神經(jīng)功能［22］。

PPI聚類分析后，交集基因分為3大模塊。各模塊GO富集分析結(jié)果表明，模塊一靶點主要參與對藥物反應(yīng)、細胞對脂多糖的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、衰老、RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程。模塊二靶點主要參與對凋亡過程負調(diào)控、細胞對缺氧的反應(yīng)、缺乏配體時的體外凋亡信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等生物學(xué)過程。模塊三靶點主要參與G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路、MAPK級聯(lián)的正調(diào)控、細胞增殖的正調(diào)控、血小板脫粒等生物學(xué)過程改善低血壓性腦梗死預(yù)后。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，升陷湯通過cGMPPKG信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路、cAMP信號通路、甲狀腺激素信號通路、鈣信號通路改善低血壓性腦梗死預(yù)后。cGMP-PKG信號通路活化，可調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生［23］，促進神經(jīng)干細胞的增殖和分化［24］，有效促進腦缺血后海馬神經(jīng)發(fā)生，改善認知功能［25］。PI3K-Akt信號通路可以通過活化Akt來刺激NF-κB信號通路、p53信號通路、甲狀腺激素信號通路，同時抑制正常細胞凋亡程序和調(diào)節(jié)血管生成［26-28］。Toll樣受體信號通路和NF-κB信號通路在局部腦缺血再灌注模型大鼠腦組織中高表達［29］，黃芪甲苷可通過TLR4/NF-κB信號通路改善血管內(nèi)皮功能障礙［30］，柴胡多糖通過影響并抑制TLR4信號通路而發(fā)揮其抗炎免疫作用［31］。柴胡皂苷A通過cAMP/CREB信號通路對腦損傷大鼠認知功能有較好的改善作用［32］。鈣超載已被公認為是腦缺血缺氧性損傷及神經(jīng)細胞死亡的共同通路，有研究顯示鈣信號作用與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)，調(diào)節(jié)透血腦屏障能力不佳的活性組分具有進行結(jié)構(gòu)修飾提高臨床療效的價值［33］。

本研究結(jié)果表明，具有益氣升提作用的升陷湯，其主要活性成分槲皮素、木樨草素等可能通過作用Akt1、TNF、RELA、IL-6、JUN、VEGFA、MYC、MAPK8、CXCL2、ESR1等關(guān)鍵靶點調(diào)節(jié)多條信號通路，發(fā)揮對低血壓性腦梗死的治療作用。升陷湯治療低血壓性腦梗死及改善預(yù)后的機制主要集中調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路抗凋亡、cGMP-PKG通路促進神經(jīng)干細胞增殖和分化等過程中。研究結(jié)果為進一步探索低血壓性腦梗死動物模型、確定治療時間窗提供了實驗依據(jù)，也有助于指導(dǎo)臨床用藥，尋找有效組分和成分、開發(fā)新劑型，為開發(fā)治療缺血性腦卒中的中藥新藥奠定基礎(chǔ)。