桃紅四物湯組方有效單體成分對早期骨折治療的量效關系研究*

余曉愉 熊 輝△ 周鈺健 楊 卓 周文佳 陸小龍

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.深圳寶安純中醫治療醫院，廣東 深圳 518000；3.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005）

在中醫學發展史進程中，度量標準經歷了多次變化，這種變化使得中醫方藥的用量不能形成一個系統完整的理論體系，阻礙了中醫藥的現代化發展［1］。量效關系是指在一定范圍內，藥物的作用效應隨著劑量（或濃度）的變化而改變［2］，歷代醫家都在不停探索中藥的最佳量效關系，他們根據自己的臨床經驗以及對中藥量效關系的認識，提出了各種不同的見解。有學者認為以中醫基礎理論及方劑組方理論為基礎，闡明中藥的量－效關聯規律［3］。仝小林教授［4］曾經提出以實驗結合文獻研究并以臨床療效評價為中心的中藥量效關系研究模式。但無論是哪種研究方式，仍處于總結前人經驗應用于實踐的階段，成熟、科學的理論依據不能夠在臨床實踐中合理運用，中醫藥臨床療效的提高受到制約。桃紅四物湯最早見于清代吳謙的《醫宗金鑒》，主要功用為活血化瘀，是治療骨折的常用方。課題組前期實驗研究表明，桃紅四物湯組方藥物主要水溶性有效單體成分組方與原方水煎劑均可促進大鼠早期骨折愈合，縮短骨折愈合時間，治療早期骨折作用無明顯差異［5］，而桃紅四物湯原方存在量效關系，療效與劑量為正相關性［6］。本研究擬從不同劑量桃紅四物湯單體成分組方對大鼠早期骨折愈合的影響，探討其量效關系，為該方的進一步應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級12周齡雄性SD大鼠90只，體質量200～220 g，購自湖南斯萊克京達實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004。動物質量合格證號：1107271911004705。湖南中醫藥大學SPF級中心實驗室喂養，室溫22～26℃，相對濕度35%～70%。

1.2 實驗藥物 桃紅四物湯單體成分：苦杏仁苷，批號20190401，貨號A0093；羥基紅花黃色素A，批號20190508，貨號A0380；梓醇，批號20190102，貨號A0215；毛蕊花糖苷，批號20190301，貨號A0943；阿魏酸，批號20190303，貨號 A0050；芍藥苷，批號 20190202，貨號A1298；川芎嗪，批號20190301，貨號A1088。單體成分均由成都曼斯特生物科技有限公司提供，按照藥典有效成分含量溶于水配成相應濃度給藥。

1.3 試劑與儀器 水合氯醛，批號20XS09R25，貨號30037517，上海浦山化工有限公司；4%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液，批號D20092506，貨號AR1071，博士德生物公司；4%多聚甲醛，批號D20061401，貨號AR1068，博士德生物公司；鼠VEGF試劑盒，批號20190509，貨號69-35236，上海森雄科技實業有限公司；80萬單位青霉素，批號2003104，貨號15140-122，華北制藥股份有限公司。ER－182 A型電子天平，日本AND公司；無菌操作臺，蘇州市蘇杭科技器材有限公司；顯微鏡，日本Motic；RM2235石蠟切片機，德國LABSTAR；KDBM電腦生物組織包埋機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；RE-2000B旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；電動玻璃勻漿器，新芝有限公司。MoticBA600-4顯微攝像圖像分析系統，麥克奧迪實業公司；Image-Pro Plus圖像分析軟件，美國Image-Pro公司。

1.4 分組與造模 將90只大鼠按隨機數字表法分為空白組（正常對照）15只、模型制備組75只。造模方法［7］：使用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉，待麻醉產生效應后，將麻醉后的大鼠采用俯臥位的方式將其固定在無菌操作臺上，將大鼠左側大腿股外側充分暴露出來，清除大鼠的毛發后，然后進行常規消毒；消毒后，用手術刀在大鼠左股外側作一3 cm左右縱向切口，向下逐層剝離各組織結構，大鼠股外側肌進行鈍性分離，上下推移股骨干使其充分顯露出來；使用骨鋸截斷股骨干中段，切下端骨皮質時用止血鉗折斷股骨干，使斷端保持其完整性；將一根直徑為1 mm的克氏針于斷端逆行插入股骨干近端，再從股骨大轉子同一側方向穿出；當骨折斷端復位后，沿克氏針方向順行穿回；術肢輕微活動，當復位完成后，剪除多余部分，縫合切口，造模完成。假手術組將對SD清潔級雄性大鼠只切開縫合不造模。進行手術后，若觀察到股骨中段橫形骨折可認為是骨折模型，發現大鼠粉碎性骨折則剔除，造模至所需樣本量，待大鼠恢復正常體溫后予以青霉素80萬單位腹腔注射，每日1次，預防感染，連續給藥3 d。將造模后的75只大鼠隨機分為假手術組、模型組及單體成分組方低、中、高劑量組，每組15只。

1.5 給藥方法 按照60 kg成人與動物體表面積換算公式［8］計算，大鼠每日給藥劑量為9 g/kg，即給予200 g體質量大鼠每日1.8 g的劑量，設定量效比值（R為1∶3）分為3個梯度，分別為1∶3∶9，中劑量組作為成人等效劑量組，則3、9、27 g/kg對應低、中、高劑量組。空白組、假手術組、模型組分別予以等體積生理鹽水灌胃。造模成功24 h內開始第1次給藥，每日給藥時間相同，每日2次，灌胃間隔時間為8 h，連續灌胃14 d。

1.6 標本采集與檢測 1）大鼠給藥3、7、14 d后分組取材，每組每次隨機選擇5只大鼠，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉后經腹主動脈采血，取出左側股骨置于4%多聚甲醛溶液中固定，固定處理后再浸泡于4%乙二胺四乙酸（EDTA）中脫鈣。2）造模前、造模后3、7、14 d 4個時相點，取大鼠左側股骨中段同一部位，剃毛后然后用紅線包圍并標記，用不銹鋼帶表卡尺測量做了標記的紅線3次，取平均值。3）骨折早期斷端病理形態變化。標本浸蠟3.5 h，石蠟包埋，切片，0.01 mol/L PBS緩沖液中沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，蘇木素-伊紅（HE）染色，封片，顯微鏡下觀察。4）血清血管內皮生長因子（VEGF）濃度檢測。造模后3、7、14 d使用酶聯免疫吸附測定（ELISA）測血清VEGF的濃度，每組每次5只，取平均值。5）骨體積（BV）和骨性骨痂體積（TV）百分比（BV/TV%）檢測。通過Micro-CT進行掃描，將造模后3、7、14 d大鼠股骨中段骨折位置和骨折處周圍的骨進行三維重建分析，可測得BV和BV/TV百分比。

1.7 統計學處理 應用SPSS25.0統計軟件。計量資料以（±s）表示。滿足正態分布者，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD法檢驗，方差不齊者用Dunnet′s T3法檢驗；不符合正態分布者用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況 造模前，各組大鼠活動自如，精神良好，飲食、二便正常。造模后，除空白組對照組外，其余各組大鼠在恢復體溫后均有活動受限，精神狀態欠佳，飲食減少變化。單體成分組方各劑量組與模型組大鼠在術后則出現造模部位紅腫，局部膚溫升高，跛行等癥狀。灌胃開始后，模型組大鼠精神狀態、飲食、活動未見明顯變化；單體成分組方低、中劑量組大鼠同給藥前相比，其一般情況均有不同程度的好轉；高劑量組大鼠精神與其余組相比精神狀態較亢奮，納食量及活動、反應力均有增加，表明在使用單體成分組方藥物灌胃能在一定程度上改善大鼠早期骨折的臨床癥狀。

2.2 各組大鼠肢體腫脹程度比較 見表1。在造模后2 h及3、7、14 d，測量大鼠肢體腫脹程度，在灌胃后3 d左右為測定肢體腫脹程度區間的峰值，隨后則呈現下降趨勢；與空白組比較，假手術組在3、7、14 d 3個時相點大鼠肢體腫脹程度不明顯（P＞0.05）；與假手術組比較，模型組大鼠在3、7、14 d 3個時相點大鼠肢體腫脹程度明顯（P＜0.01）；與模型組比較，各劑量組大鼠在3、7、14 d 3個時相點肢體腫脹程度均有減輕，其中以高劑量減輕最為明顯（P＜0.05或P＜0.01）。提示單體成分組方具有消除大鼠早期骨折肢體腫脹的作用，量效呈正相關，高劑量組效果最好。

表1 各組大鼠肢體腫脹程度比較（cm，±s）

表1 各組大鼠肢體腫脹程度比較（cm，±s）

注：與空白組比較，☆P＜0.01，☆☆P ＜0.05；與假手術組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.01，△△P＜0.05；與低劑量組比較，★P＜0.01，★★P＜0.05。下同。

組別空白組假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 5 5 5 5 5 5造模后2 h 4.043±0.102 4.150±0.203 4.934±0.135*4.896±0.129 4.616±0.071△△★★4.581±0.024△△★灌胃3 d 4.073±0.112 4.142±0.209 5.729±0.279*5.443±0.181△△5.0715±0.106△△★★4.871±0.100△★灌胃7 d 4.704±0.100 4.143±0.210 5.464±0.155*5.273±0.094△△4.972±0.132△△★★4.510±0.186△★灌胃14 d 4.170±0.113 4.145±0.149 5.349±0.104*5.043±0.110△△4.616±0.124△△★★4.171±0.140△★

2.3 各組大鼠血清VEGF含量比較 見表2。與空白組比較，假手術組在3、7、14 d 3個時相點大鼠血清VEGF濃度表達均有所增加（P＜0.05）；與假手術組比較，模型組在3、7、14 d 3個時相點大鼠血清VEGF濃度表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各劑量組在3、7、14 d 3個時相點大鼠血清VEGF濃度表達均有明顯增加，其中以高劑量增加最為明顯（P＜0.05或P＜0.01）。說明單體成分組方能夠促進血清中VEGF的表達，從而加速早期骨折的愈合，量效呈正相關。

表2 各組大鼠血清VEGF含量比較（ng/L，±s）

表2 各組大鼠血清VEGF含量比較（ng/L，±s）

組別空白組假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 5 5 5 5 5 5灌胃3 d 106.240±6.651 111.290±6.820☆☆125.320±5.010*137.780±5.900**149.01±9.492**△★★163.010±7.391*△★灌胃7 d 110.062±9.114 115.101±8.294☆☆138.502±5.704*149.404±4.705**159.984±9.424**△★★180.104±5.805*△★灌胃14 d 107.332±6.445 108.550±7.219☆☆152.292±6.249*164.245±7.020**175.540±8.229**△★★202.016±8.940*△★

2.4 各組大鼠骨體積（BV）值、大鼠骨體積分數（BV/TV）值比較 見表3，圖1。與模型組比較，單體成分組方各劑量組在3、7、14 d 3個時相點大鼠BV值、BV/TV值均有所增加，其中均以高劑量組增加最為明顯（P＜0.05或P＜0.01），低、中劑量組間差異不明顯。

表3 各組大鼠BV值、BV/TV比值比較（±s）

表3 各組大鼠BV值、BV/TV比值比較（±s）

組別模型組（n=5）低劑量組（n=5）中劑量組（n=5）高劑量組（n=5）時間灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d灌胃3 d灌胃7 d灌胃14 d BV值37.397±2.270 42.159±3.129 51.259±4.029 44.340±3.279△△54.316±2.850△△64.392±2.900△△46.259±4.640△△55.501±2.995△△68.620±3.690△△51.407±3.104△★★62.605±3.702△★★74.625±4.159△★★BV/TV比值0.020±0.534 0.200±0.051 0.172±0.0 52 0.238±0.764△△0.345±0.017△△0.443±0.076△△0.273±0.447△△0.447±0.014△△0.501±0.015△△0.376±0.053△★★0.741±0.046△★★0.841±0.448△★★

圖1 術后大鼠股骨顯微Micro-CT圖像

2.5 各組大鼠組織病理學分析結果 病理切片結果顯示：空白組和假手術組大鼠骨皮質連續，與骨小梁互相連接形成海綿狀向骨髓腔延伸，骨小梁間充于骨髓（見圖2 A、B）；灌胃3 d后，可見模型組骨折斷端骨皮質不連續，局部骨組織壞死（見圖2 C1）；3個給藥組血腫機化，出現少量的軟骨、成骨、破骨細胞及肉芽組織，骨折斷端開始連接（見圖2 D1、E1、F1）；灌胃7 d，模型組骨折斷端開始初步連接，可見少量軟骨細胞及肉芽組織形成（見圖2 C2）；各劑量組則可見到不同程度軟骨細胞骨化、鈣化，骨痂及骨髓腔形成，其中高劑量組已出現少量骨小梁（見圖2 D2、E2、F2）；灌胃14 d，模型組軟骨細胞進一步增多，已可見少量纖維骨痂和軟骨痂，少量骨小梁，無環狀骨痂及骨髓腔形成；3個給藥組大量軟骨痂鈣化，可見新生骨髓腔，平行于股骨縱軸、排列規則且致密的新生骨小梁數量逐漸增加，以高劑量組最為顯著（見圖2 D3、E3、F3）。

圖2 術后大鼠股骨切片（HE染色，40倍）

3 討論

骨折愈合是一個復雜的過程，其最基本的過程為骨折部位募集祖細胞形成初始軟骨痂，經過血管再吸收、骨形成和骨化后骨折愈合［9］。骨折斷端血管生成是促進骨折愈合的重要因素，而骨折斷端血運被阻斷，血管生成速度緩慢且不連續，這是臨床治療骨折最需要攻克的兩大難題［10］。VEGF能夠促進骨折斷端血液循環中內皮細胞分化增長，并提供氧氣、養料，從而加速血管生成速度，骨折斷端血運得以重建，初步連接骨折斷端［11］。VEGF還能通過協調各類骨細胞，激發其運動分化功能，從而促進創傷性骨折的修復與愈合［12-14］。VEGF的表達和生成受多種細胞影響，原始骨細胞及成骨細胞受到刺激后會分泌促血管生成因子，其中就包括VEGF，其中成骨細胞是VEGF的主要來源之一［15］。課題組前期研究表明單體成分組方能夠顯著提高VEGF的表達，促進骨折斷端血管新生，同時促進骨折愈合，縮短骨折愈合時間［5］。

中醫認識疾病和治病的基本原則是辨證論治，在臨床實踐中，同一中藥復方可用于治療不同疾病的類似證型，雖然中藥復方基本相同，但對于不同疾病，中藥的使用劑量往往不同，所有對于中藥復方來說，其“治療窗”較寬，而“劑量閾”相對較低。近年來中藥復方量效關系的研究思路越來越多，但并沒有形成一個完整的理論體系，有基于數據挖掘的方式，以人為本體，對各類古籍及現代名老中醫醫案中的方劑藥物劑量進行系統整理，從中得出量效規律［16-17］。也有針對效應物質的研究，學者通過藥效物質基礎層面，運用中藥血清藥理學、代謝組學等研究方式來剖析中藥復方量效關系［18］。亦有將臨床療效評價為出發點中心，將醫案、實驗及文獻多重結合的方式，歸納總結劑量的合理范圍，正確認識“量”和“效”的相對關系［19］。目前，關于中藥復方量效的關系研究仍處于摸索階段，建立和健全具有中醫藥特色的量效關系研究方法及體系，用科學正確的方法詮釋中藥復方量效關系，是中醫藥現代化進程中必須解決的重大問題。

本實驗研究結果顯示，通過觀察大鼠一般情況、測量肢體腫脹度、測定血清VEGF濃度、運用顯微CT和光學顯微鏡技術，明確了桃紅四物湯單體成分組方可以通過調控VEGF表達水平達到加速早期骨折愈合的作用，且存在量效關系，其療效與劑量、時相點呈正相關性，其中以桃紅四物湯單體成分組方高劑量組療效最佳。這與上文論述的實驗結果及文獻報道基本一致。本研究為桃紅四物湯單體成分組方加速早期骨折愈合更深入的機制研究提供了實驗基礎，為后期的臨床應用提供了更多依據。