二月蘭種子中甘藍鏈格孢帶菌率檢測及6種殺菌劑對病菌的毒力測定

王春明　元維偉　郭成　周天旺　金社林

摘要：測定了二月蘭葉斑病病原菌甘藍鏈格孢種子帶菌率及6種殺菌劑對其的毒力。結(jié)果顯示，二月蘭種子上存在葉斑病病原菌甘藍鏈格孢，其帶菌率為31.3%。98%咯菌腈對甘藍鏈格孢具有良好的殺菌效果，EC50值為0.091 2 μg/mL;97%異菌脲、95%戊唑醇和95%吡唑醚菌酯殺菌效果較好，EC50值分別為0.1974 μg/mL、0.373 3 μg/mL和0.609 9 μg/mL;98%嘧菌酯和98%多菌靈效果較差，EC50值分別為146.855 1 μg/mL和134.495 4 μg/mL。綜上認(rèn)為，二月蘭葉斑病病菌甘藍鏈格孢具有種子傳播危害的可能，98%咯菌腈對其具有較好毒力，其次為97%異菌脲、95%戊唑醇和95%吡唑醚菌酯。

關(guān)鍵詞：二月蘭葉斑病;甘藍鏈格孢;殺菌劑;病原菌;抑制率;毒力測定

中圖分類號：S436.8 ? ? ?文獻標(biāo)志碼：A ? ? ?文章編號：1001-1463（2021）04-0018-05

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.04.006

Detection of Carrying Rate of Alternaria brassicicola of Orychophragmus violaceus seed and Toxicity

Measurement of Six Fungicides on Bacteria

WANG Chunming 1， YUAN Weiwei 2， GUO Cheng 1， ZHOU Tianwang 1， JIN Shenlin 1

（1. Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. College of Plant Protection， Funjian Agriculture and Forestry University， Fuzhou ?Fujian 350002， China）

Abstract：The carrying rate of Alternaria brassicicola of Orychophragmus violaceus seed and toxicity measurement of 6 fungicides on the bacteria were determined. The results showed that separation ratio of Alternaria brassicicola was 31.3%in Orychophragmus violaceus seeds. Meantime toxicity measurement results showed that 98% Fludioxonil good bactericidal effect on Alternaria brassicicola of Orychophragmus violaceus，and the EC50 values was 0.091 2 μg/mL. The higher toxicity were 97% Iprodione， 95%Tebuconazole and 95% Pyraclostrobin， and the EC50 values were 0.197 4 μg/mL， 0.373 3 μg/mL and 0.609 9 μg/mL， respectively. The lowest toxicity were 98% Azoxystrobin and 98% Carbendazim， and the EC50 values were 146.855 1 μg/mL and 134.495 4 μg/mL， respectively. In conclusion， Alternaria brassicicola of Orychophragmus violaceus had the possibility of seed dispersal harm， and 98% Fludioxonil had best virulence to Alternaria brassicicola of Orychophragmus violaceus， then 97% Iprodione， 95% Tebuconazole and 95% Pyraclostrobin.

Key words：Leaf spot of Alternaria.brassicicola; Orychophragmus violaceus; Fungicide; Pathogenic bacteria; Inhibition rate; Toxicity measurement

二月蘭為諸葛菜屬二年生植物，目前多被用作景觀綠化植物種植。同時，二月蘭具有良好的改良土質(zhì)、培肥地力的效果[1 - 4 ]，在生產(chǎn)上也常被用作重要的綠肥作物種植利用，如華北地區(qū)形成的二月蘭—春玉米種植模式，不僅使農(nóng)田土壤裸露現(xiàn)象和生態(tài)環(huán)境有所改善，而且還具有提高玉米產(chǎn)量等作 用[1 ]。隨著二月蘭種植面積的擴大，病蟲害的發(fā)生已成為影響其產(chǎn)量、限制其應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。2017年綠肥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系旱地病蟲害綜合防控崗位項目組在對河北省二月蘭種植區(qū)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，黃驊市二月蘭葉斑病發(fā)生嚴(yán)重，發(fā)病葉片正面形成形狀不一、具明顯同心輪紋狀的黑色病斑，發(fā)生嚴(yán)重田塊葉部病斑密集，嚴(yán)重者葉片枯死。對采集的病樣進行分離、單孢純化，共獲得兩種分離物，經(jīng)形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定其分別為甘藍鏈格孢和細(xì)極鏈格孢，選取甘藍鏈格孢菌株GS1-1和細(xì)極鏈格孢菌株H1-1進行致病性測定發(fā)現(xiàn)，菌株GS1-1能引起二月蘭葉斑病，接種葉片發(fā)病癥狀同田間相似，證明甘藍鏈格孢為二月蘭葉斑病致病菌[5 - 6 ]。甘藍鏈格孢是多種十字花科蔬菜葉部病害的主要病原菌[7 - 11 ]，可通過蕓薹屬和蘿卜屬植物的種子及雜草等進行傳播危害[8 ]。肖博文等[12 - 13 ]在對二月蘭種子攜帶真菌種類的研究中發(fā)現(xiàn)，甘藍鏈格孢也存在種子傳播侵染二月蘭致病的可能，但優(yōu)勢種群及甘藍鏈格孢帶菌率未見具體統(tǒng)計。為了明確甘藍鏈格孢在二月蘭種子中的帶菌率，且為有效的防治該病害提供科學(xué)依據(jù)，我們進行了二月蘭種子中甘藍鏈格孢帶菌率檢測及6種藥劑對二月蘭葉斑病病原菌甘藍鏈格孢菌毒力測定，旨在為二月蘭葉斑病流行的研究及綜合治理提供依據(jù)。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 試驗材料

供試材料為二月蘭種子，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所禾谷類病害研究室提供。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。供試菌株為甘藍鏈格孢GS1-1菌株，由綠肥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系旱地病蟲害綜合防控崗位項目組分離自二月蘭葉片，PDA斜面保存。供試原藥分別為95%戊唑醇、97%異菌脲、98%多菌靈、95%吡唑醚菌酯、98%咯菌腈和98%嘧菌酯，均由天津東方農(nóng)藥有限公司提供。

1.2 ? 試驗方法

1.2.1 ? ?種子帶菌率檢測 ? ?隨機選取300粒二月蘭種子，將其放置到倒好的PDA平板上，每皿擺放種子10粒，置于（25±0.5） ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，逐天觀察菌落生長情況。根據(jù)菌落顏色及形狀差異等分別純化菌種，統(tǒng)計種子攜帶的真菌種類和甘藍鏈格孢分離頻率。

1.2.2 ? ?6種藥劑對二月蘭葉斑病病原菌菌絲生長的影響 ? ?采用菌絲生長速率抑制法。將供試殺菌劑分別融入二甲基亞砜中稀釋成系列濃度梯度的母液，按一定比例加入融化好的PDA培養(yǎng)基中，混勻后倒入無菌一次性培養(yǎng)皿中，制成系列濃度梯度的含藥培養(yǎng)基平板，具體稀釋濃度見表1。菌落長至培養(yǎng)皿近邊緣時，用0.5 cm的打孔器在菌落邊緣打取菌落塊，移接到上述含藥的培養(yǎng)基平板中央，每皿放1塊菌落塊，重復(fù)3次，以加入同等二甲基亞砜的PDA培養(yǎng)基為對照。置（25±0.5） ℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，計算藥劑對菌絲生長的抑制率[14 - 16 ]。

菌絲生長抑制率%=[（對照菌落直徑-菌餅直徑）-（處理菌落直徑-菌餅直徑）]/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100。

1.3 ? 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Excel 2010及DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計算各藥劑對菌株的有效抑制中濃度（EC50）值、95%置信區(qū)間、相關(guān)系數(shù)（R）及毒力回歸方程。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 種子帶菌率檢測

對分離結(jié)果統(tǒng)計可知，分離純化出的真菌種類分屬于鏈格孢屬、鐮刀菌屬、根霉屬、青霉屬、黑附球菌屬等。鏈格孢屬真菌為優(yōu)勢種群，分離頻率高達65.2%，其中甘藍鏈格孢占31.3%，其他鏈格孢占33.9%。甘藍鏈格孢分生孢子形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)顯微特征分別見圖1A、圖1B。

2.2 ? 6種殺菌劑對甘藍鏈格孢菌菌絲生長的影響

從表1可知，在試驗劑量范圍內(nèi)，相同稀釋濃度下以98%咯菌腈對其菌絲抑制效果最好;其次為97%異菌脲、95%戊唑醇和95%吡唑醚菌酯;98%嘧菌酯和98%多菌靈的效果較差。98%咯菌腈在稀釋濃度為0.100 μg/mL時抑制率為56.04%，97%異菌脲在稀釋濃度10 μg/mL時抑制率為89.46%，95%戊唑醇在稀釋濃度5 μg/mL時抑制率為85.76%，95%吡唑醚菌酯在稀釋濃度10 μg/mL時抑制率為75.77%。這4種藥劑對二月蘭葉斑病菌有較好的抑制效果。

2.3 ? 6種殺菌劑對二月蘭葉斑病菌甘藍鏈格孢室內(nèi)毒力測定結(jié)果

由表2可以看出，6種殺菌劑對供試菌株均具有一定的殺菌活性，且不同藥劑之間毒力存在差異。回歸方程相關(guān)系數(shù)為0.981 4～0.998 7，相關(guān)性強。其中98%咯菌腈對二月蘭葉斑病病原菌具有良好的殺菌活性，EC50值為0.091 2 μg/mL，95%置信區(qū)間為0.050 8～0.163 5;其次為97%異菌脲、95%戊唑醇和95%吡唑醚菌酯，EC50值分別為0.197 4 μg/mL、0.373 3 μg/mL和0.609 9 μg/mL，95%置信區(qū)間分別為0.072 0～ 0.540 7、0.266 6～0.522 8和0.491 2～0.609 9;98%嘧菌酯和98%多菌靈效果較差，EC50值分別為146.855 1 μg/mL和134.495 4 μg/mL，95%置信區(qū)間分別為43.784～492.563 9和106.051 9～ 170.567 6。

3 ? 結(jié)論與討論

試驗表明，二月蘭種子中存在二月蘭葉斑病病原菌甘藍鏈格孢，其分離頻率達31.3%，進一步證實了二月蘭葉斑病存在種子帶菌傳播的可能，與肖博文等[12 - 13 ]報道的結(jié)論相一致。種子處理是預(yù)防種傳病害最有效、最經(jīng)濟的措施之一。種子處理的方法主要有物理法、生物法和化學(xué)法，尤其化學(xué)處理法在生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛，種子經(jīng)過處理后能有效清除種子中攜帶的病原菌，能在一定程度上減輕土傳病害對種子和幼苗的危害[17 ]。本研究發(fā)現(xiàn)，98%咯菌腈對二月蘭葉斑病病原菌具有良好的殺菌活性，EC50值為0.091 2 μg/mL，95%置信區(qū)間為0.050 8～ 0.163 5;97%異菌脲、95%戊唑醇和95%吡唑醚菌酯殺菌效果較好，EC50值分別為0.197 4 μg/mL、0.373 3 μg/mL和0.609 9 μg/mL，95%置信區(qū)間分別為0.072 0～0.540 7、0.266 6～0.522 8和0.491 2～0.609 9;98%嘧菌酯和98%多菌靈殺菌效果較差，EC50值分別為146.855 1 μg/mL和134.495 4 μg/mL，95%置信區(qū)間分別為43.784 0～492.563 9和106.051 9～170.567 6。以上結(jié)果可為二月蘭葉斑病的田間防治提供一定的參考，但在實際施用過程中應(yīng)考慮環(huán)境條件、藥劑劑型及寄主抗病性等多種因素的制約，藥劑田間防治濃度及具體施用浸種、拌種，還是種子包衣方法等有待于進一步研究。

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（本文責(zé)編：鄭立龍）

收稿日期：2021 - 02 - 03

基金項目：綠肥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系旱地病蟲害綜合防控崗位（CARS-22-G-20）;甘肅省科技計劃項目（20JR5RA108）;嘉峪關(guān)市科技計劃項目（20-17）。

作者簡介：王春明（1979 — ），女，甘肅武威人，副研究員，碩士，主要從事農(nóng)作物病害及抗病性鑒定研究工作。Email： wchm179@126.com。

通信作者：金社林（1965 — ），男，山西武功人，研究員，博士，主要從事禾谷類和綠肥作物病害防控研究。Email：jinshelin@163.com。